ماهنامه علمی پ‍ژوهشی

مقدمه
سرطان کبد به عنوان هفتمین سرطان شایع و دومین سرطان کشنده در سطح جهانی شناخته می‌شود. کارسینوم هپاتوسلولار (HCC) که ۷۵ تا ۸۵ درصد از کل موارد سرطان کبد را تشکیل می‌دهد، فرم غالب سرطان کبد است (1). سه نوع روش جراحی شامل پیوند کبد، برداشت بخشی از کبد و تخریب بافت کبدی مؤثرترین روش‌های درمانی برای HCC  به‌شمار می‌روند. با این‌حال، هیچ‌ یک از این روش‌ها درمان دائمی ارائه نمی‌دهند و هر کدام محدودیت‌های خاص خود را دارند. علی‌رغم کاربرد محدود شیمی‌درمانی، داروهای خاصی مانند اتوپوزاید در مقابله با HCC مؤثر شناخته شده‌اند (2). اتوپوزاید، مشتق نیمه‌صناعی از آنتی‌بیوتیک طبیعی پودوفیلوتوکسین، یک داروی مهم شیمی‌درمانی ضد سرطان است که با مهار آنزیم توپوایزومراز II و تکثیر DNA، رشد سلول‌های سرطانی را متوقف می‌کند (3). گزارش‌های متعدد در شرایط آزمایشگاهی و مطالعات حیوانی نشان داده‌اند که اتوپوزاید باعث القای آپوپتوز (مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلولی) و پیری سلولی در خطوط سلولی مختلف می‌شود و اثرات ژنوتوکسیک متنوعی از جمله القای جهش و اختلال در سنتز DNA ایجاد می‌کند (4). اکسیداسیون گروه‌های تیول توسط رادیکال‌های فنوکسی اتوپوزاید ممکن است منجر به کاهش سطح گلوتاتیون، افزایش گونه های فعال اکسیژن و افزایش آسیب اکسیداتیو به DNA شود که این امر به نوبه خود در تشکیل شکست‌های رشته‌ای DNA نقش دارد (5). از آنجا که اتوپوزید عوارض جانبی متعددی برای بیماران به همراه دارد، جستجوی روش‌های نوین مانند درمان ترکیبی به منظور کاهش این عوارض و در عین حال افزایش اثرات ضدتوموری آن مورد توجه قرار گرفته است (6). گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) نقش مهمی در پاتوژنز بسیاری از بیماری‌ها از جمله سرطان، بیماری‌های عصبی-تخریبی، سیستم تنفسی و دستگاه گوارش ایفا می‌کنند. سطوح بالای ROS در سلول‌های طبیعی باعث آسیب به DNA، لیپیدها و پروتئین‌ها شده و به جهش‌زایی و تبدیل سلولی می‌انجامد. از سوی دیگر، سلول‌های سرطانی با سطوح بالای ROS ناشی از تغییرات متابولیک و افزایش نیاز انرژی مشخص می‌شوند. ROS در مراحل مختلف توسعه سرطان مانند تبدیل سلولی، تهاجم و متاستاز نقش دارند (7). از آنجا که استرس اکسیداتیو در آسیب‌های حاد و مزمن کبدی نقش دارد، استفاده از آنتی‌اکسیدان‌های طبیعی گزینه مناسبی برای پیشگیری از آسیب کبدی به‌شمار می‌اید. آلفا-توکوفرول فعال‌ترین و مؤثرترین فرم ویتامین E است که به‌طور گسترده در طبیعت یافت می‌شود. خواص آنتی‌اکسیدانی آلفا-توکوفرول در توانایی آن برای حذف رادیکال‌های آزاد تولید شده از بیومولکول‌های لیپیدی نهفته است و در نهایت زنجیره واکنش رادیکال‌های آزاد را متوقف می‌کند و به عنوان یک آنتی‌اکسیدان محلول در چربی است که نقش مهمی در حفاظت از غشای سلولی در برابر آسیب اکسیداتیو ایفا می‌کند، هم‌چنین آلفا-توکوفرول می‌تواند خطر بسیاری از بیماری‌های مزمن مرتبط با استرس اکسیداتیو، از جمله سرطان و بیماری‌های قلبی عروقی را کاهش دهد (8,9). علاوه بر ظرفیت‌های آنتی‌اکسیدانی، آلفا- توکوفرول به عنوان تنظیم‌کننده ژن‌های دخیل در متابولیسم و هموستازی لیپیدها، سیگنالینگ سلولی، تنظیم بیان ژن، التهاب و سیستم دفاع ایمنی عمل می‌کند (10,11). آسپارتیک اسید، که در فرم یونیزه خود به نام آسپارتات نیز شناخته می‌شود، یک آمینو‌اسید آلفا با فرمول شیمیایی C4H7NO4 است و به عنوان یک اسید آمینه غیرضروری محسوب می‌شود (12). نقش آسپارتیک اسید به عنوان یک مهارکننده مستقیم رادیکال‌های آزاد اکسیژن، همراه با حمایت غیرمستقیم آن از سیستم‌های آنتی‌اکسیدانی درون‌زا مانند گلوتاتیون، به‌طور مؤثری با فعالیت آنتی‌اکسیدانی قوی و محلول در چربی آلفا-توکوفرول هماهنگ می‌شود. آلفا- توکوفرول به‌ویژه در خنثی‌سازی رادیکال‌های لیپید پراکسیل بسیار مؤثر است و بدین ترتیب از غشای سلولی در برابر آسیب‌های اکسیداتیو محافظت می‌کند. وقتی آلفا-توکوفرول با آسپارتیک اسید ترکیب می‌شود که نه تنها رادیکال‌های آزاد اکسیژن را حذف می‌کند، بلکه از طریق افزایش فعالیت آنزیم‌هایی مانند سوپراکسید دسموتاز و کاتالاز، دفاع آنتی‌اکسیدانی سلول را تقویت می‌کند نتیجه، یک سیستم دفاعی جامع‌تر و قوی‌تر در برابر استرس اکسیداتیو خواهد بود (13). ترکیب اسید آسپارتیک و توکوفرول یک رویکرد درمانی قانع‌کننده برای مقابله با استرس اکسیداتیو کبد به دلیل مکانیسم‌های اثر مکمل آن‌ها ارائه می‌کند. در حالی‌که هر ترکیب به‌طور جداگانه اثرات آنتی‌اکسیدانی قابل‌توجهی را اعمال می‌کند، تعامل هم‌افزایی آن‌ها به‌طور بالقوه یک استراتژی محافظتی برتر در مقایسه با درمان‌های آنتی‌اکسیدانی فعلی ارائه می‌دهد. با توجه به موارد بیان شده در این مطالعه اثرات هم‌افزایی آسپارتیک اسید و توکوفرول بر سمیت سلولی و استرس اکسیداتیو ناشی از اتوپوزاید بر رده سلولی HepG2 به روش MTT و ROS مورد بررسی قرار گرفت.
روش بررسی
در مطالعه تجربی حاضر، رده سلولی سرطانی کبد (HepG2) از بانک سلولی انستیتو پاستور تهران خریداری شد. سلول ها در محیط کشت DMEM-HG (Gibco)  که حاوی 10% سرم جنین گاوی FBS (Gibco) و 1% آنتی بیوتیک پنی سیلین‌استرپتومایسین در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی گراد و رطوبت کافی و میزان 5 درصد دی اکسید کربن  نگهداری شدند. پس از آنکه سلول‌ها به 70% رشد سلولی رسیدند توسط تریپسین-EDTA از کف فلاسک جدا شده و در دور 1500 rpm به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ شدند. از رســـوب سلولی ایجاد شده سوسپانسیون تهیـه شد و درصد زنده ماندن سلول‌ها با رنگ تریپان بلو و لام هموسایتومر توسط میکروسکوپ نوری تعیین شد (14).
تست سمیت سلولی به روش MTT: به هر چاهک پلیت 96 خانه، سوسپانسیون سلولی که حاوی 10⁴ سلول HepG2 افزوده شد. 24 ساعت پس از کشت سلول‌های سرطانی کبد HepG2، آسپارتیک اسید و آلفا-توکوفرول در غلظت‌های (400و200 و 100 و 50 و 25 و10 میکرومولار) و پس از گذشت 24 ساعت دیگر، داروی اتوپوزاید در غلظت IC50 معادل 7/08 میکرومولار به سلول‌ها اضافه شدند. پس از 24 ساعت، به هر چاهک پلیت 20 میکرولیتر محلول MTT اضافه و پلیت به مدت 4 ساعت انکوبه شد. پس از سپری شدن زمان مذکور، محلول MTT درون چاهک‌ها خارج شد و 150 میکرولیتر محلول DMSO به هر چاهک افزوده شد. سپس با دستگاه Elisa-reader جذب نوری هر چاهک در طول موج 570 نانومتر اندازه‌گیری شد (15).
سنجش میزان ROS: برای اندازه‌گیری میزان ROS از معرف DCFH-DA در گروه‌های کنترل و تیمار استفاده شد. میزان 20 میکرولیتر از معرف به نمونه سلولی اضافه و در دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 15دقیقه نگهداری شد. سـپس جذب توسط دستگاه فلوریمتری و در طول موج تحریکی 312 نانومتر و طول موج نشـری 420 نانومتر اندازه‌گیری شد (16).
سنجش میزان پراکسیداسیون لیپیدی (LPO): پس از انکوباسیون، سلول‌ها با استفاده از روش اسید تیوباربیتوریک (TBA)  مورد ارزیابی قرار گرفتند. برای این منظور، به 0/2 میلی‌لیتر از هر یک از گروه‌های سوسپانسیون سلولی 0/1 میلی‌لیتر از معرف TBA اضافه شد. سپس مواد مذکور به‌طور کامل مخلوط شده، در حمام آب گرم قرار داده شدند و به مدت 30 دقیقه انکوبه گردیدند. پس از سرد شدن نمونه‌ها، 0/2 میلی‌لیتر n-بوتانول به مخلوط اضافه و کاملاً تکان داده شد و به مدت 10 دقیقه در سرعت 3500 دور در دقیقه سانتریفیوژ گردید. در نهایت، لایه n-بوتانول در طول موج 532 نانومتر جدا شده و میزان ترکیبات تیوباربیتوریک اسید(TBARs)  با استفاده از منحنی استاندارد محاسبه شد (16). 
تجزیه تحلیل آماری
کلیه محاسبات آماری برای مقایسه IC₅₀ ها با استفاده از نرم‌افزار آماری Prism Ver.8 و به روش رگرسیون غیرخطی (nonlinear Regression) انجام شد و مقایسه داده‌ها با روش آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) و Post test مربوطه (Tukey- Kramer multiple comprehension test) صورت گرفته و نمودارها توسط همین برنامه گرافیگی رسم شدند. حد معناداری (p<0.05) تعریف شده است.
نتایج
اثر وابسته به دوز اتوپوزاید در مهار رشد سلول‌های HepG2: به منظور بررسی اثرات سایتوتوکسیستی داروی اتوپوزاید بر سلول‌های HepG2، غلظت‌های مختلف دارو (2/5 ، 5 ، 10، 20، 40، 80  میکرومولار) در زمان 48 ساعت با سلول‌ها مواجه شدند. همانطور که در نمودار 1 نشان داده شده است، نتایج مطالعه نشان داد که تیمار سلول‌ها با اتوپوزاید باعث کاهش قابل توجه زیست‌پذیری سلولی به‌صورت وابسته به دوز شد. در این مطالعه مقدار IC50 داروی اتوپوزاید در رده سلولی HepG2 مواجهه با داروی اتوپوزاید، 7/08 میکرومولار تعیین شد و برای ادامه مطالعه این دوز استفاده شد.
اثر آسپارتیک اسید به همراه اتوپوزاید بر رشد سلول‌هایHepG2 : همانطور که در نمـودار 2 نشـان داده شـده است، سلولهای HepG2 مواجه شده بـا اتوپوزاید در غلظـت  IC50باعـث کـاهش رشـد شـده اسـت. بـا تیمار سلول‌های HepG2 با آسپارتیک اسید در غلظت‌هـای از پـیش تعیین شده، باعـث مهـار سمیت اتوپوزاید و افزایش رشـد سلول‌ها شده است به‌طوری‌که این تـأثیر وابسـته به دوز بوده است. در مقایسه آماری سلول تیمار شده با اتوپوزاید با گروه کنترل مشخص شد که دارای اختلاف معنادار بود (P<0.001). هم‌چنین، در غلظت 10 میکرومولار آسپارتیک اسید به همراه اتوپوزاید تفاوت معناداری با گروه اتوپوزاید به‌تنهایی دیده نشده است (P>0.05)، اما تیمار سلول‌ها با آسپارتیک اسید 25 میکرومولار به همراه اتوپوزاید باعث افزایش معنادار زنده‌مانی سلول‌ها شد (P<0.01). در ادامه، زنده‌مانی سلول‌هایی که آسپارتیک اسید را در غلظت‌های 50، 100، 200، و 400 میکرومولار دریافت کردند بیشتر از سلول‌های دریافت کننده آسپارتیک اسید 25 میکرومولار، به‌صورت وابسته دوز به افزایش یافت (P<0.001). با این وجود، زنده‌مانی تمامی سلول‌های القای سمیت شده‌ای که آسپارتیک اسید دریافت کردند نسبت به گروه کنترل همچنان کمتر بود (P<0.001).
اثر آلفا-توکوفرول به همراه اتوپوزاید بر رشد سلول‌های HepG2: براساس نمودار 3، زنده‌مانی سلول‌های HepG2 تیمار شده با اتوپوزاید به‌طور معناداری نسبت به گروه کنترل کاهش یافته است (P<0.001). از لحاظ مقایسه آماری زنده‌مانی سلول‌ها در غلظت‌های50، 100، 200، و 400 میکرومولار آلفا-توکوفرول به همراه اتوپوزاید دارای اخـتلاف معنی‌داری با گروه اتوپوزاید بودند (P<0.001) و در غلظت‌های 10 و 25 میکرومولار به همراه اتوپوزاید تفاوت معنی‌داری با اتوپوزاید به تنهایی دیده نشده است.
اثر آلفا-توکوفرول و آسپارتیک اسید به همراه اتوپوزاید بر رشد سلول های HepG2: با افزایش غلظت های آلفا-توکوفرول + آسپارتیک اسید به همراه اتوپوزاید در نمودار 4 حیات سلول های HepG2 افزایش یافته است. به‌طوری‌که در تمامی غلظت‌ها باعث افزایش معنادار زنده مانی سلول ها شدند بدین شکل که برای غلظت 10 میکرومولار اختلاف معناداری (p<0.01) و در سایر غلظت‌ها p<0.001 نسبت به گروه اتوپوزاید به‌تنهایی بودند.
اثر آلفا-توکوفرول و آسپارتیک اسید به همراه اتوپوزاید بر سلول های HepG2 با بررسی پارامتر ROS: در نمودار 5 نشان داده شده اسـت کـه اتوپوزاید در غلظت   IC50 باعث افزایش میزان ROS در سلول‌هـای کبدی شده است. از طرفی دیگر در تیمار سـلول‌هـا در غلظت‌های تعیین شـده آلفا-توکوفرول و آسپارتیک اسید بـه همـراه داروی اتوپوزاید میزان ROS به‌طـور معنـاداری کـاهش پیدا کرده است. از نظـر مقایسه آمـاری در غلظـت‌هـای 25، 50، 100، 200، و 400 میکرومولار آلفا-توکوفرول و آسپارتیک اسید بـه همـراه اتوپوزاید و همچنین در غلظت 10 تفـاوت معنی‌داری بـا گـروه اتوپوزاید به‌تنهایی نشان داده است که به ترتیب P<0.001 و P<0.01 می‌باشد.
اثر آلفا-توکوفرول و آسپارتیک اسید به همراه اتوپوزاید بر پراکسیداسیون لیپیدی MDA بر سلول های HepG2: با توجه به نتایج در نمودار 6، القای سمیت سلولی با استفاده از اتوپوزاید، باعث افزایش معنی‌دار سطح مالون‌دی‌آلدئید نسبت به گروه کنترل شد (p<0.001). تیمار سلول‌ها با استفاده از ترکیب آسپارتیک اسید و توکوفرول در غلظت 10، 25، 50، 100، 200، 400 میکرومولار باعث کاهش معنی‌دار مالون‌دی‌آلدئید نسبت به گروه صرفا دریافت کننده اتوپوزاید شد (p<0.01) برای غلظت اول و (P<0.001) برای 5 غلظت بعدی). با این وجود سطح مالون‌دی‌آلدئید تمامی گروه‌های تیمار شده با ترکیب آسپارتیک اسید + آلفا توکوفرول به‌صورت معناداری بیشتر از گروه کنترل بود (p<0.001).
 




نمودار 1: سمیت غلظت‌های مختلف اتوپوزاید در سلول‌های HepG2، داده‌ها به‌صورت انحراف‌معیار ± میانگین ارائه شده است.




نمودار 2: اثر غلظت‌های آسپارتیک اسید (10، 25، 50، 100، 200، و 400 میکرومولار ) به همراه اتوپوزاید در غلظت IC50 بر رشد سلول‌های HepG2
*** دارای اختلاف معنی‌دار با گروه کنترل(P<0.001). ### دارای اختلاف معنی‌دار با گروه اتوپوزاید (P<0.001). ## دارای اختلاف معنی‌دار با گروه اتوپوزاید (P<0.01)






نمودار 3: اثر غلظت‌های آلفا-توکوفرول (10، 25، 50، 100، 200، و 400 میکرومولار ) به همراه اتوپوزاید در غلظت IC50 بر رشد سلول‌های HepG2
*** دارای اختلاف معنی‌دار با گروه کنترل(p<0.001). ### دارای اختلاف معنی‌دار با گروه اتوپوزاید (p<0.001)





نمودار 4: اثر غلظت های آلفا-توکوفرول + آسپارتیک اسید (10، 25، 50، 100، 200، و 400 میکرومولار ) به همراه اتوپوزاید در غلظت IC50 بر رشد سلول‌های HepG2
*** دارای اختلاف معنی دار با گروه کنترل(P<0.001). ### دارای اختلاف معنی دار با گروه اتوپوزاید (P<0.001). ## دارای اختلاف معنی دار با گروه اتوپوزاید (P<0.01)




نمودار 5: اثر غلظت‌های آلفا-توکوفرول + آسپارتیک اسید (10، 25، 50، 100، 200، و 400 میکرومولار) به همراه اتوپوزاید در غلظت IC50 بر میزان ROS در سلول‌های HepG2
*** دارای اختلاف معنی‌دار با گروه کنترل(P<0.001) ### دارای اختلاف معنی‌دار با گروه اتوپوزاید (P<0.001). ## دارای اختلاف معنی‌دار با گروه اتوپوزاید (P<0.01)





نمودار 6: اثر غلظت‌های آلفا-توکوفرول + آسپارتیک اسید (10، 25، 50، 100، 200، و 400 میکرومولار ) به‌همراه اتوپوزاید در غلظت IC50 بر میزان MDA در سلول‌های HepG2
*** دارای اختلاف معنی‌دار با گروه کنترل(P<0.001). ### دارای اختلاف معنی‌دار با گروه اتوپوزاید (P<0.001) ## دارای اختلاف معنی‌دار با گروه اتوپوزاید (P<0.01)
 
بحث
در مطالعه حاضر، اثرات هم‌افزایی آسپارتیک اسید و توکوفرول بر سمیت سلولی و استرس اکسیداتیو ناشی از اتوپوزاید بر رده سلولی سرطانی کبد (HepG2) با استفاده از سنجش زنده‌مانی سلولی به روش MTT، اندازه‌گیری سطح رادیکال‌های آزاد اکسیژن و پراکسیداسیون لیپیدی مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به نتایج به‌دست آمده از نمودارها، آلفا توکوفرول در غلظت‌های 10 و25 میکرومولار نتوانست زنده‌مانی سلول‌ها را افزیش دهد ولی در باقی غلظت‌های مورد آزمایش (50، 100، 200، 400 میکرومولار) زنده‌مانی سلولی را به‌طور معنی‌داری افزایش داد. هم‌چنین آسپارتیک اسید نیز در غلظت 10 میکرومولار بر زنده‌مانی سلولی اثری نداشت اما در غلظت‌های (25، 50، 100، 200، 400 میکرومولار) زنده‌مانی سلولی را به‌ طور معنی‌داری افزیش داد. در حالی‌که ترکیب آسپارتیک اسید + آلفا-توکوفرول در تمامی غلظت‌های آزمایش شده (10، 25، 50، 100، 200، 400 میکرومولار) باعث افزایش زنده‌مانی سلولی، کاهش پراکسیداسیون لیپیدی و ROS شد. استرس اکسیداتیو، که به عنوان عدم تعادل اکسیداسیون-کاهش به نفع بار اکسیدان تعریف می‌شود، یکی از مهم‌ترین رویدادهای زیستی در پیشرفت سرطان است. سلول‌های سرطانی معمولاً سطح اکسیدان بالاتری دارند که این موضوع یک استراتژی درمانی دوگانه را با تنظیم وضعیت ردوکس پیشنهاد می‌کند (17). اتوپوزید اثرات ضدسرطانی خود را از طریق ایجاد شکست‌های رشته‌ای در DNA با مهار توپوایزومراز II اعمال می‌کند که منجر به آپوپتوز سلول‌های سرطانی می‌شود. با وجود استفاده گسترده از این دارو، چالش‌هایی مانند مقاومت دارویی، سمیت و اثربخشی محدود در سرطان، تحقیقات مداومی را در زمینه درمان‌های ترکیبی و فرمولاسیون‌های جدید دارویی به دنبال داشته است (18). مطالعات نشان دادند که اسید آسپارتیک خواص آنتی‌اکسیدانی خود را عمدتاً از طریق از بین بردن رادیکال‌های آزاد و مهار گونه‌های فعال اکسیژن نشان می‌دهد. یک مطالعه قابل‌توجه اثرات شلات‌های آسپارتات با فلزات روی، منیزیم، مس و منگنز را بررسی کرد و نشان داد که این شلاته‌ها از تشکیل رادیکال‌های اکسیژن توسط آنزیم‌هایی مانند گزانتین اکسیداز و NADPH اکسیداز در لکوسیت‌های انسانی جلوگیری می‌کنند. مشخص شد که شلاته آسپارتات‌ با مس و یا منگنز فعالیت، آنزیم‌های سوپراکسید دیسموتاز را که در مدیریت استرس اکسیداتیو در سلول‌ها حیاتی هستند، تقلید می‌کند (19). Tang و همکاران در سال2020 با هدف بررسی تاثیر گلوتامات و آسپارتات در کاهش استرس اکسیداتیو بافت بیضه/ اپیدیدیم ناشی از تزریق هیدروژن پراکساید در بافت اسکروتوم گراز یک مطالعه انجام دادند. نتایج این مطالعه نشان داد که مکمل‌های گلوتامات و آسپارتات باعث بهبود مورفولوژی بیضه و کاهش شاخص تناسلی در گرازهای تیمار شده با هیدروژن پراکساید شد. تجویز گلوتامات و آسپارتات فعالیت آنزیم آنتی‌اکسیدانی را افزایش داد و بر ترشح سیتوکین التهابی بیضه تأثیر گذاشت، اما تأثیری بر سطح هورمون جنسی نداشت (20). در مطالعه Venditti و همکاران در سال 2021 نقش D-Aspartic Acid در مقابله با سمیت ناشی از اتان دی متان سولفونات در بافت بیضه موش صحرایی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج به‌دست ‌آمده نشان داد که D-Aspartic Acid ممکن است به عنوان یک استراتژی برای کاهش اثرات سمی اعمال شده توسط آلاینده‌های محیطی به منظور حفظ عملکرد تولید‌مثلی استفاده شود (21). در سال2020 Ichikawa  و همکاران تاثیر آسپارتیک اسید بر نفروتوکسیسیته مزمن در موش‌های دیابتی مورد مطالعه قرار دادند. نتایج حاصل از مطالعه نشان داد که بهبود آلبومینوری ممکن است ناشی از کاهش استرس اکسیداتیو در کلیه‌ها به دلیل دریافت آسپارتیک اسید باشد که در ادامه، منجر به بهبود لایه سطحی اندوتلیال گلومرولی شود (22). در مطالعه Rabaca و همکاران در سال 2020 که به  ارزیابی تأثیر NAC (N-Acetyl Cysteine) بر حفظ کیفیت اسپرم در طی قرار گرفتن در معرض اتوپوزید به صورت آزمایشگاهی پرداختند مشخص شد که  NACتوانست در طول درمان با اتوپوزید در شرایط آزمایشگاهی، یکپارچگی DNA اسپرم را حفظ کند، که نشان می‌دهد NAC ممکن است به عنوان یک عامل کمکی برای حفظ باروری مردان در طول درمان‌های شیمی‌درمانی مفید باشد (23). Lee و همکاران در سال 2023 بررسی کردند که اوکراتوکسین به دلیل سمیت بالا و وجود آن در طیف وسیعی از محصولات کشاورزی و محصولات غذایی مشتق شده از آن‌ها، از جمله غذاها و میان وعده‌های مخصوص نوزادان و کودکان خردسال، یک نگرانی نوظهور است. در نتایج حاصل از این مطالعه نشان داده شد  آلفا-توکوفرول از طریق کاهش سمیت سلولی و تقویت سیستم‌های دفاع آنتی‌اکسیدانی، آسیب کلیوی و استرس اکسیداتیو ناشی از اوکراتوکسین را کاهش داد (24). از این‌رو مطالعه حاضر هم‌راستا با مطالعات انجام شده می‌باشد. هم‌چنین مطالعات خواص آنتی‌اکسیدانی آلفا- توکوفرول را در ترکیب با سایر ترکیبات مورد بررسی قرار دادند و نشان دادند که در ترکیب با آنتی‌اکسیدان‌های دیگر، اثرات هم‌افزایی قوی دارد. Wang و همکاران در سال 2020 در یک مطالعه ترکیب آلفا توکوفرول با استرهای گالیک اسید را در امولسیون‌های روغن در آب بررسی کردند. نتایج نشان داد که آلفا توکوفرول، هنگامی‌که با پروپیل گالات ترکیب می‌شود، به‌طور قابل‌توجهی ظرفیت آنتی‌اکسیدانی آن را افزایش می‌دهد. این مکانیسم بازسازی به آلفا توکوفرول اجازه می‌دهد تا مدت طولانی‌تری فعال بماند و اثربخشی آن را در محافظت از لیپیدها در برابر تخریب اکسیداتیو بهبود بخشد (25). در مطالعه حاضر نیز آلفا- توکوفرول به همراه آسپارتیک اسید توانستند سبب کاهش پراکسیداسیون لیپیدی و گونه‌های فعال اکسیژن شوند. در یک بررسی Vineetha و همکاران در سال2020 اثرات ضد سرطانی ترکیب آلفا-توکوفرول و ال-اسکوربیک اسید را در سمیت سلولی القا شده توسط آرسنیک تری اکسید در سلول‌های لوسمی رده HL-60 مورد بررسی قرار دادند. نتایج نشان داد که ترکیب ال-اسکوربیک اسید و آلفا توکوفرول سمیت سلولی آرسنیک‌تری اکسید را در سلول‌های HL-60 تقویت می‌کند که با تشدید وضعیت اکسیدانی (کاهش GSH، کاتالاز و سوپراکسید دسموتاز)، پتانسیل غشایی میتوکندری و مهار فاکتور Nrf2 همراه بود (26). از این‌رو، نتیجه این مطالعه با مطالعه حاضر در یک راستا نبود.Sánchez  و همکاران در سال 2022 یک مطالعه به بررسی مکانیسم حفاظتی -αتوکوفرول بر روی لیپیدهای غشای سلولی آستروسیت های انسانی تحت فشار پاراکوات پرداختند. استرس ناشی از قرار گرفتن در معرض پاراکوات به‌طور قابل‌توجهی باعث کاهش زنده‌مانی سلولی و تغییرات لیپید غشایی مانند افزایش گونه‌های خاصی از سرامیدها که واسطه‌های لیپیدی مسیرهای آپوپتوز هستند، شد. پیش‌درمان سلول‌ها با -αتوکوفرول، این اثرات را کاهش داد، زنده‌مانی سلول را افزایش داد و پروفایل لیپیدی را در آستروسیت‌های تیمار شده با پاراکوات تعدیل کرد (27). .در مطالعه‌ای دیگر در سال 2022 به بررسیاثر آلفا-توکوفرول بر اثرات منفی آکریل آمید در یک مدل in-vivo پرداختند. برای این منظور جنین مرغ داخل تخم با استفاده از یک نیدل، در معرض آکریل آمید، -αتوکوفرول و ترکیبی از این مواد قرار گرفتند. پس از 48 ساعت قرار گرفتن در معرض، نمونه‌های مغز را جمع‌آوری کردند و سنجش‌های بیوشیمیایی را برای بررسی اثر مواد انتخابی بر استرس اکسیداتیو (MDA و گلوتاتیون) را انجام دادند. نتایج نشان داد که غلظت MDA در گروهی که آکریل آمید دریافت کرده بودند به‌طور معنی‌داری افزایش یافت، در حالی‌که در گروه با آلفا توکوفرول، غلظت مشاهده شده در مقایسه با گروه کنترل کمتر بود. علاوه بر این، کاهش غلظت گلوتاتیون پس از تجویز آکریل آمید مشاهده شد (28). در نتیجه این مطالعه، با مطالعه حاضر در یک راستا بود. 
نتیجه‌گیری
به‌طورکلی با توجه به نتایج حاصل از این مطالعه به‌نظر می‌رسد که ترکیب آسپارتیک اسید+ آلفا-توکوفرول باعث بهبود پارامترهای استرس اکسیداتیو و افزایش ظرفیت آنتی‌اکسیدانی در رده سلولی (HepG2) مواجهه یافته با اتوپوزاید شد. بهبود پارامترهای استرس اکسیداتیو بستگی به میزان مصرف این ترکیبات دارد. 
سپاس‌گزاری
این مقاله حاصل پایان‌نامه خانم مریم تنگشتانی‌زاده برای اخذ درجه دکتری حرفه‌ای در رشته داروسازی عمومی از دانشگاه علوم پزشکی مازندران-پردیس خودگردان رامسر می‌باشد. 
حامی مالی: هزینه‌های توسط معاونت محترم تحقیقات و فناوری دانشگاه علوم پزشکی مازندران- پردیس خودگردان رامسر تامین شد.
تعارض در منافع: وجود ندارد.
ملاحظات اخلاقی
این مطالعه در «کمیته اخلاق در پژوهش دانشگاه علوم پزشکی مازندران » با کد اخلاق IR.MAZUMS.3.REC.1402.18080 به تصویب رسیده است.
مشارکت نویسندگان
دکتر محمد شکرزاده در ارائه ایده، محبوبه رحمتی کوکنده در طراحی مطالعه، مریم تنگستانی زاده در جمع‌آوری داده‌ها، حورالعین عرب و الهه قره خانی در تجزیه و تحلیل داده‌ها مشارکت داشته و همه نویسندگان در تدوین، ویرایش اولیه و نهایی مقاله و پاسخگویی به سوالات مرتبط با مقاله سهیم هستند.
 

References:
 
1-    Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin 2021; 71(3): 209-49.
2-    Aslani F, Afarin R, Madiseh ND, Nasab HB, Monjezi S, Igder S, et al. Potentiation of Apoptotic Effect of Combination of Etoposide and Quercetin on Hepg2 Liver Cancer Cells. Hepatitis Monthly 2023; 23(1): e136194.
3-        Shah Z, Gohar UF, Jamshed I, Mushtaq A, Mukhtar H, Zia-UI-Haq M, et al. Podophyllotoxin: History, Recent Advances and Future Prospects. Biomolecules 2021; 11(4): 603.
4-    Shokrzadeh M, Ghassemi-Barghi N. Protective Effect of Amifostine Against Etoposide-Induced Genotoxicity Evaluated by the Comet Assays. Symbiosis 2018; 25: 28.
5-    Papież M. The Effect of Quercetin on Oxidative DNA Damage and Myelosuppression Induced by Etoposide in Bone Marrow Cells of Rats. Acta Biochim Pol 2014; 61(1): 7-11. 
6-    Fathi-Karkan S, Arshad R, Rahdar A, Ramezani A, Behzadmehr R, Ghotekar S, et al. Recent Advancements in the Targeted Delivery of Etoposide Nanomedicine for Cancer Therapy: A Comprehensive Review. Eur J Med Chem 2023; 259: 115676.
7-    Kluska M, Juszczak M, Żuchowski J, Stochmal A, Woźniak K. Effect of Kaempferol and Its Glycoside Derivatives on Antioxidant Status of HL-60 Cells Treated With Etoposide. Molecules 2022; 27(2): 333.
8-    Qu Y, Tang J, Liu L, Song L, Chen S, Gao Y. Α-Tocopherol Liposome Loaded Chitosan Hydrogel to Suppress Oxidative Stress Injury in Cardiomyocytes. Int J Biol Macromol 2019; 125: 1192-202. 
9-    Na Y, Woo J, Choi WI, Lee JH, Hong J, Sung D. Α-Tocopherol-Loaded Reactive Oxygen Species-Scavenging Ferrocene Nanocapsules with High Antioxidant Efficacy for Wound Healing. Int J Pharm 2021; 596: 120205. 
10-    Traber MG, Atkinson J. Vitamin E, Antioxidant and Nothing More. Free Radic Biol Med 2007; 43(1): 4-15. 
11-    Wallert M, Ziegler M, Wang X, Maluenda A, Xu X, Yap ML, et al. Α-Tocopherol Preserves Cardiac Function by Reducing Oxidative Stress and Inflammation in Ischemia/Reperfusion Injury. Redox biology 2019; 26: 101292.
12-    Cupp MJ, Tracy TS. Dietary Supplements: Toxicology and Clinical Pharmacology. New york: Springer Science & Business Media; 2002.
13-    Sacheck JM, Blumberg JB. Role of Vitamin E and Oxidative Stress in Exercise. Nutrition 2001; 17(10): 809-14.
14-    Shokrzadeh M, Motafeghi FS, Lotfizadeh A, Ghorbani M, Haddadi Kohsar A. Cytotoxicity and Mineralization Activity of Calcium Silicate‐Based Root Canal Sealers Compared to Conventional Resin‐Based Sealer in Human Gingival Fibroblast Cells. Int J Dent 2023; 2023: 4376579. 
15-    Rahmati M, Jourablou S, Gharehkhani E, Arab H, Shokrzadeh M. Evaluating the Protective Effects of L-Arginine Against Cisplatin-Induced Cytotoxicity, Genotoxicity, and Oxidative Stress in Normal Kidney Cells and Human Blood Lymphocytes. J Mazandaran Univ Med Sci 2024; 34(236): 29-41.[Persian]
16-    Motafeghi F, Gerami M, Mortazavi P, Khayambashi B, Ghassemi-Barghi N, Shokrzadeh M. Green Synthesis of Silver Nanoparticles, Graphene, and Silver-Graphene Nanocomposite Using Melissa Officinalis Ethanolic Extract: Anticancer Effect on MCF-7 Cell Line. Iran J Basic Med Sci 2023; 26(1): 57-68.
17-    Jiang H, Zuo J, Li B, Chen R, Luo K, Xiang X, et al. Drug-Induced Oxidative Stress in Cancer Treatments: Angel or Devil? Redox Biol 2023; 63: 102754.
18-    Jang JY, Kim D, Im E, Kim ND. Etoposide as a Key Therapeutic Agent in Lung Cancer: Mechanisms, Efficacy, and Emerging Strategies. Int J Mol Sci 2025; 26(2): 796.
19-    Sadak MS, Sekara A, Al-Ashkar I, Habib-Ur-Rahman M, Skalicky M, Brestic M, et al. Exogenous Aspartic Acid Alleviates Salt Stress-Induced Decline in Growth by Enhancing Antioxidants and Compatible Solutes While Reducing Reactive Oxygen Species in Wheat. Front Plant Sci 2022; 13: 987641.
20-    Tang W, Wu J, Jin S, He L, Lin Q, Luo F, et al. Glutamate and Aspartate Alleviate Testicular/Epididymal Oxidative Stress by Supporting Antioxidant Enzymes and Immune Defense Systems in Boars. Sci China Life Sci 2020; 63(1): 116-24.
21-    Venditti M, Romano MZ, Aniello F, Minucci S. Preliminary Investigation on the Ameliorative Role Exerted by D-Aspartic Acid in Counteracting Ethane Dimethane Sulfonate (EDS) Toxicity in the Rat Testis. Animals 2021; 11(1): 133.
22-    Ichikawa S, Gohda T, Murakoshi M, Li Z, Adachi E, Koshida T, et al. Aspartic Acid Supplementation Ameliorates Symptoms of Diabetic Kidney Disease in Mice. FEBS Open Bio 2020; 10(6): 1122-34.
23-    Rabaça A, Ferreira C, Bernardino R, Alves M, Oliveira P, Viana P, et al. Use of Antioxidant Could Ameliorate the Negative Impact of Etoposide on Human Sperm DNA During Chemotherapy. Reprod Biomed Online 2020; 40(6): 856-66.
24-    Lee HJ, Kim HD, Ryu D. Protective Effect of Alpha-Tocopherol Against Ochratoxin a in Kidney Cell Line HK-2. J Food Prot 2023; 86(5): 100082.
25-    Wang Y, Wu C, Zhou X, Zhang M, Chen Y, Nie S, et al. Combined Application of Gallate Ester and Α-Tocopherol in Oil-In-Water Emulsion: Their Distribution and Antioxidant Efficiency. J Dispersion Science and Technology 2020; 41(6): 909-17.
26-    Vineetha RC, Hariharan S, Jaleel A, Chandran M, Nair RH. L-Ascorbic Acid and Α-Tocopherol Synergistically Triggers Apoptosis Inducing Antileukemic Effects of Arsenic Trioxide Via Oxidative Stress in Human Acute Promyelocytic Leukemia Cells. Front  Oncology 2020; 10: 65.
27-    Sánchez-Sánchez L, Fernández R, Ganfornina MD, Astigarraga E, Barreda-Gómez G. Protective Actions of Α-Tocopherol on Cell Membrane Lipids of Paraquat-Stressed Human Astrocytes Using Microarray Technology, MALDI-MS and Lipidomic Analysis. Antioxidants (Basel) 2022; 11(12): 2440.
28-    Kopańska M, Batoryna M, Banaś-Ząbczyk A, Błajda J, Lis MW. The Effect of Α-Tocopherol on the Reduction of Inflammatory Processes and the Negative Effect of Acrylamide. Molecules 2022; 27(3): 965.