ماهنامه علمی پ‍ژوهشی

مقدمه
بر اساس برآوردهای آژانس بین‌المللی تحقیقات سرطان (International Agency for Research on Cancer) مبنی بر 18/1 میلیون مورد جدید ابتلا به سرطان و مرگ 9/6 میلیون نفر ناشی از آن در سال 2018 و افزایش نرخ بروز آن به 27/5 میلیون نفر تا سال 2040، سرطان به سرعت در حال تبدیل شدن به مهم‌‌ترین مسئله بهداشت در جهان است (1). در میان انواع مختلف سرطان، گزارش‌های اپیدمیولوژیک منتشر شده حاکی از افزایش قابل توجه میزان بروز (2/09 میلیون مورد جدید در سال 2018) و مرگ و میر (627000 نفر در سال 2018) ناشی از سرطان پستان، طی دو دهه گذشته در نقاط مختلف جهان بوده است (2, 1). سرطان پستان با ناهمگنی و میزان عود بالا و پیش¬آگهی ضعیف (3) به سه زیرگروه؛ گیرنده استروژن مثبت، (HER2) Human epidermal growth factor receptor 2 مثبت و سه گانه منفی دسته‌بندی می‌شود. مبتلایان به زیر گروه استروژن مثبت معمولا با تاموکسیفن و مهارکننده‌‌های آروماتاز، بیماران HER2 مثبت عمدتاً با تراستوزومب (آنتی‌بادی مونوکلونال علیه HER2) و بیماران سه گانه منفی درپی عدم بیان ملکول¬های خاص از طریق عوامل شیمی درمانی استاندارد نظیر دوستاکسل و دوکسوروبیسین تحت درمان قرار می‌گیرند (4-7) که مصرف آنها عوارض جانبی بالقوه، از جمله ورم لنفاوی، کاهش وزن، درد و نوروپاتی محیطی را در مبتلایان به دنبال دارد. علاوه بر این، اگرچه سرطان پستان در ابتدا به شیمی‌درمانی مرسوم پاسخ می‌دهد، اما در نهایت در مرحله پیشرفته بیماری مقاومت پیدا کرده و برخی بیماران در عرض پنج سال عود را نشان می‌دهند. از این‌رو یک نیاز فوری برای ایجاد راهکارهای درمانی موثرتر، نسبت به روش¬های مرسوم به منظور بهبود طول بقاء مبتلایان احساس می‌شود. مانند سایر انواع سرطان¬ها، مقاومت در برابر مرگ برنامه‌ریزی شده سلولی (آپوپتوز) و تکثیر کنترل نشده سلول¬ها از ویژگی¬های اصلی سرطان سینه است که بر اثربخشی درمان تأثیر می¬گذارد (8). آپوپتوز نوعی خودکشی سلولی است که توسط سیگنال‌های خارج سلولی (مسیر خارجی) یا درون سلولی (مسیر داخلی) ایجاد شده (9) و با خصوصیات بیوشیمیایی همچون، فشردگی سلولی، قطعه قطعه شدن هسته، تراکم کروماتین، قطعه قطعه شدن DNA، تخریب mRNA و تشکیل اجسام آپوپتوتیک ظاهر می‌شود (10). وقوع بیش از حد آپوپتوز آتروفی را در پی خواهد داشت، در حالی‌که آپوپتوز ناکافی با تکثیر سلولی کنترل نشده همراه است. در سلول‌های طبیعی پستان، تعادلی بین تکثیر سلولی و آپوپتوز، برای حفظ هموستاز سلولی وجود دارد. اختلال در این تعادل، یعنی فعال شدن مسیر پیام رسان ضد آپوپتوزی یا نقص در مسیر پیشبرنده آپوپتوز می‌تواند منجر به تکثیر کنترل نشده سلولی، مقاومت درمانی و عود سلول‌های سرطانی پستان شود (8). در سلول‌های سرطانی پستان، عوامل متعددی از جمله، فاکتور رشد، آسیب DNA، گونه‌های فعال اکسیژن و پرتوهای رادیواکتیو می‌توانند رشد کنترل نشده سلولی را از طریق مسیرهای پیام رسان میتوکندریایی، PI3K/AKT، FasL/Fas، با واسطه فاکتور هسته‌‌ای κB و با واسطه MAPK افزایش دهند (11). بنابراین، تنظیم بقا و مرگ سلولی در سطح مولکولی در فرآیند آپوپتوز می‌تواند یک استراتژی درمانی کارآمد برای سرطان پستان باشد (8). اخیرا فواید پروبیوتیک¬ها در برابر سرطان پستان مشخص شده است (12). پروبیوتیک‌‌ها (باکتری‌‌ها یا مخمرها) به عنوان میکروارگانیسم‌های زنده‌‌ای تعریف می‌شوند که وقتی در مقادیر کافی (در غذا یا به عنوان مکمل¬های غذایی) تجویز شوند، برای میزبان مفید هستند. رایج‌ترین سویه‌های باکتریایی مورد استفاده برای اهداف پروبیوتیک، باکتری‌های اسید لاکتیک (گروهی از میکروارگانیسم¬های گرم مثبت، کاتالاز منفی، غیر متحرک، بی‌هوازی یا میکروآئروفیل) هستند که به‌طور طبیعی در محصولات غذایی تخمیر شده وجود دارند. ترکیبات سنتز شده توسط این باکتری‌های معمولاً سمیت سلولی پایینی دارد و فاقد عوارض جانبی خاصی می¬باشند (13). نشان داده است که باکتری‌های اسید لاکتیک می‌توانند در تنظیم آپوپتوز سلولی از طریق مسیرهای درونی (فعال¬سازی پروتئین¬های آپوپتوزی Bax و Bak یا غیرفعال¬سازی پروتئین¬های ضد آپوپتوزی خانواده Bcl-2) و بیرونی (از طریق گیرنده¬های Fas/TNFR یا سایر عوامل برای القای مسیر مرتبط با کاسپاز) نقش داشته باشند. باکتری¬های اسید لاکتیک القای آپوپتوز به واسطه 5-فلوروئوراسیل را افزایش داده و باعث فعال شدن مرگ سلولی، مستقیماً با القای Beclin-1 و GRP78 و به‌طور غیرمستقیم از طریق القای Bcl-2 و Bak می¬شوند. باکتری‌های اسید لاکتیک نیز ممکن است از طریق کاهش‌دهنده‌ محصولات ژنی وابسته به فاکتور هسته‌ای NF-κB که بقا سلولی را به واسطه ژن¬های ضد آپوپتوزی Bcl-2 و Bcl-xL تنظیم می¬کند، از سرطان جلوگیری نمایند (14). در میان گونه¬های لاکتوباسیلوس، یک پروبیوتیک مهم لاکتوباسیلوس ساکئی است که اثرات ضد چاقی (15)، ضد کولیت روده (16)، آنتی‌اکسیدانی (17)، تحریک کننده سیستم ایمنی (18)، ضد میکروبی (19)، ضد دیابت و ضد ملانوژنیک (20) و ضد سرطانی (22, 21) متابولیت¬های تولیدی آن شناخته شده است. با این‌حال، با توجه به نیاز به تحقیقات هر چه بیشتر جهت تایید اثرات ضد سرطانی آن، از آنجائیکه تاکنون هیچ پژوهشی برای ارزیابی اثر سوپرناتانت لاکتوباسیلوس ساکئی بر تنظیم مرگ برنامه¬ریزی شده سلول¬های سرطانی پستان در سطح مولکولی وجود ندارد، در تحقیق حاضر اثر سوپرناتانت باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس ساکئی بر میزان بیان ژن-های آپوپتوزی در رده سلولی MCF-7 سرطان پستان مورد بررسی قرار می¬گیرد.
روش بررسی
این مطالعه¬ پژوهشی به¬صورت تجربی در مراکز تحقیقات سلولی - تکوینی و باکتری‌شناسی مجتمع آزمایشگاهی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد انجام شد. رده سلول سرطانی پستان (MCF-7) و باکتری مورد نظر تحقیق یعنی لاکتوباسیلوس ساکئی (IBRC-M 10666) از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران خریداری گردید.
کشت میکروبی و سلول سرطانی: برای به¬دست آوردن سوپرناتانت ابتدا باکتری لاکتوباسیلوس ساکئی بر روی محیط کشت نوترینت آگار (NA) در دمای C‏ °37 به مدت 24 ساعت انکوبه گردید، سپس با استفاده از سوآپ استریل از کلنی باکتری مورد نظر برداشته و درون محیط کشت (TSB) استریل شده کشت داده شد و درون انکوباتور شیکردار (GFL 3033, Germany) به  صورت شیب‌‌دار در دمای C°40 با دور rpm 250 قرار گرفت. بعد از گذشت 72 ساعت کشت میکروبی در دور  g12000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد سپس سلول¬ها از سوپرناتانت جداسازی شد و از سوپرناتانت سلول¬ها جهت بررسی فعالیت ضد سرطانی استفاده گردید (22, 21). رده سلولی MCF-7  از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران خریداری شد. در محیط کشت DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) (Gibco, USA) حاوی 10 درصد FBS (Foetal Bovine Serum) (Gibco, USA) و یک درصد Penstrep (Penicillin-Streptomycin) (Gibco, USA) در انکوباتور (Memmert, Germany) با فشار 5 درصد گاز 2CO، رطوبت 90 درصد و دمای 37 درجه سانتی‌گراد، در فلاسک 75 کشت داده شد. محیط کشت هفته‌ای سه بار تعویض و برای برداشت کردن سلول‌ها از محلول تریپسین/ EDTA استفاده شد.
سنجش توان زیستی: توان زیستی سلول‌های رده‌ MCF-7 تیمار شده با غلظت‌های مختلف سوپرناتانت باکتری لاکتوباسیلوس ساکئی توسط تست MTT، با استفاده از کیت (CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTT) با شماره محصول G4000 مورد ارزیابی قرار گرفت. به این ترتیب که تعداد 103×5 سلول در هر چاهک پلیت 96 چاهکی کشت داه شد و سپس با غلظت‌های 1، 2، 3، 4 و 5 میلی‌‌گرم/ میلی¬لیتر سوپرناتانت ساکئی برای مدت زمان 24، 48 و 72 ساعت تیمار و انکوبه گردید. پس از اتمام زمان انکوباسیون، محیط رویی تیمار گردآوری شد و مقدار µl 20 محلول MTT به هر چاهک اضافه گردید و انکوباسیون چهار ساعته صورت گرفت. در نهایت جذب نمونه‌ها توسط دستگاه (ELISA-reader, Awareness Technology, USA) با طول موج nm 570 خوانش گردید (22). اطلاعات مربوط به اثر غلظت¬های مختلف سوپرناتانت لاکتوباسیلوس ساکئی بر رشد سلول MCF-7 با شاخص IC50 (غلظتی از دارو که رشد سلول را نسبت به کنترل 50 درصد کاهش می¬دهد) ارائه شدند. IC50ها از طریق رسم منحنی¬های رشد سلول در برابر رقت‌های مختلف سوپرناتانت و از طریق رسم معادله رگرسیون غیر خطی منحنی¬های رشد سلول در برابر غلظت سوپرناتانت محاسبه گردید.
سنجش بیان ژن: به منظور بررسی میزان بیان ژن¬های Bax  و Bcl2، تعداد 105×3 سلول در پلیت¬های 6 خانه کشت داده شد، و سپس، با غلظت 5 میلی¬گرم/ میلی¬لیتر از سوپرناتانت لاکتوباسیلوس ساکئی در بازه¬ زمانی 72 ساعت تیمار و انکوبه شدند. پس از گذشت زمان انکوباسیون، سلول‌ها در دو گروه تست شامل غلظت 5 میلی¬گرم/ میلی¬لیتر از سوپرناتانت لاکتوباسیلوس ساکئی و گروه کنترل، برداشت و پس از شستشو با بافر PBS، Total RNA سلولی با استفاده از معرف RNXTM –PLUS (RNX-Plus Solution for total RNA isolation)، جدا گردید. به منظور انجام مرحله Heat block، نمونه‌های حاصل از مرحله¬ی قبل در دستگاه ترموسایکلر با دمای 60 درجه سانتی گراد به مدت 20 دقیقه قرار داده شدند. در ادامه تمام توالی‌‌های RNA با استفاده از کیت سنتز cDNA (PrimeScriptTM RT Reagent kit (Perfect Real Time))، (Takara)، به cDNA تبدیل و به فریزر 20- درجه سانتی‌گراد منتقل شدند. سنجش میزان بیان ژن‌های Bax و Bcl2 با استفاده از دستگاه Real Time PCR مدل (Rotor gene 3000 corbett, Australia) مورد ارزیابی قرار گرفت. برای انجام واکنش، مخلوط واکنشی متشکل از cDNA، به مقدار 1 میکرولیتر، پرایمر رفت و برگشت هر کدام به مقدار 0/5 میکرولیتر، RNase-free water، به مقدار 5/5 میکرولیتر و 12/5 میکرولیتر مسترمیکس (Master Mix RT-PCR) (Ampliqon) تهیه گردید (23). توالی پرایمرهای پیشرو (Forward) و پسرو (Reverse) ژن¬های GAPDH، Bax و Bcl2 با استفاده از نرم افزار Oligo6 طراحی و سپس با Blast نمودن آن‌ها در NBCI از صحیح بودن آنها اطمینان حاصل شد و نهایتاً توسط شرکت Macrogen سنتز شدند (جدول 1). از ژن GAPDH، به عنوان کنترل داخلی استفاده شد. سپس مخلوط واکنش پس از آماده‌سازی با حجم نهایی 20 میکرولیتر تحت تاثیر برنامه‌ی دمایی ذکر شده در جدول 2 قرار گرفت.
تجزیه و تحلیل آماری
نهایتاً بررسی آماری با استفاده از آزمون و من ویتنی (به‌طورکلی آزمون ناپارامتریک به نرمال بودن یا نبودن توزیع داده‌ها حساس نیست و در هر شرایطی قابل استفاده است) از طریق نرم‌افزارversion 16  SPSS انجام شد. حدود اطمینان برای همه آزمایشات 95% در نظر گرفته شد و 5% < P معنی-دار محسوب گردید.
نتایج
توان زیستی سلول‌های رده‌ MCF-7 تیمار شده با غلظت‌های سوپرناتانت لاکتوباسیلوس ساکئی (1، 2، 3، 4 و 5 میلی‌گرم/ میلی‌‌لیتر)، پس از گذشت زمان‌های سه گانه‌ انکوباسیون (24، 48 و 72 ساعت) با استفاده از تست MTT مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل شده از این تست حاکی از آن می‌باشد که توان زیستی سلول‌های MCF-7 سرطان پستان، در مقایسه با گروه کنترل در دوزهای مختلف سوپرناتانت لاکتوباسیلوس ساکئی (1، 2، 3 و 4 میلی‌‌گرم/ میلی‌‌‌لیتر) تفاوت معنی‌داری نداشته و توان زیستی سلول‌ها در دوز 5 میلی‌گرم/ میلی‌‌لیتر به پایین‌‌ترین مقدار خود رسیده است (شکل 1 و 2). در این روش غلظت سوپرناتانت لاکتوباسیلوس ساکئی در نقطه IC50 به عنوان غلظتی که بقای سلولی را 50 درصد کاهش می‌‌دهد 5 میلی‌گرم/ میلی¬لیتر بوده است (جدول3).
 




جدول 1: مشخصات پرایمر مربوط به ژن¬های BAX، BCL-2 و GAPDH



       


جدول 2: شرایط دمایی واکنش Rael Time PCR

 






شکل1: تاثیر غلظت  5 میلی گرم/ میلی لیتر (غلظتی که سبب کاهش 50 درصدی بقای سلولی گردید) سوپرناتانت لاکتوباسیلوس ساکئی بر رده سلولی MCF-7 برای مدت زمان انکوباسیون 24، 48 و 72 ساعت





شکل2: تاثیر غلظت¬های مختلف سوپرناتانت لاکتوباسیلوس ساکئی بر توان زیستی سلول¬های رده MCF-7 در مدت زمان انکوباسیون 24، 48 و 72 ساعت

جدول3: غلظت 5 میلی گرم/ میلی لیتر سوپرناتانت لاکتوباسیلوس ساکئی در نقطه IC50 در روش MTT




تیمار سلول های رده  MCF-7با دوز 5 میلی گرم/ میلی‌لیتر سوپرناتانت لاکتوباسیلوس ساکئی و انکوباسیون آن برای مدت 72 ساعت، افزایش معنی دار میزان بیان ژن  BAX  (p-value=0/0033) و کاهش معنی دار میزان بیان ژن(p-value=0/0278) BCL-2  را نشان داد. نمودارهای زیر این تغییر بیان را در ژن های BAX  و BCL-2 براساس CtΔΔ نمایش می‌دهند (شکل3)





شکل3: نمودار میزان بیان ژن¬های BAX و BCL-2 براساس Ct در غلظت¬ 5 میلی گرم/ میلی لیتر سوپرناتانت لاکتوباسیلوس ساکئی و زمان انکوباسیون 72 ساعت
 
بحث
سالیان دراز  باکتری ها به عنوان دشمنان انسان شناخته می‌شدند، شاید عجیب باشد اما واقعیت این است که همه باکتری ها مضر نبوده و بعضی از خانواده¬های باکتریایی نظیر پروبیوتیک ها گاها مفید نیز هستند و امروزه از آنها در ساخت داروها، هورمون ها، واکسن ها و آنزیم ها به عنوان یک جزء اصلی در فرآیند تولید استفاده می¬شود. پروبیوتیک ها، میکروارگانیسم‌های زنده و مشخصی هستند که درصورت مصرف در انسان یا حیوان، با اثر بر روی فلور میکروبی بدن باعث اعمال اثرات مفید بر سلامتی میزبان می‌شوند . اکثر پروبیوتیک ها متعلق به گروه بزرگی از باکتری های اصلی فلور میکروبی روده انسان بوده و در آنجا زندگی همسفرگی بی‌ضرری دارند. باور موجود در مورد اثرات مفید پروبیوتیک‌ها، بر پایه این واقعیت قرار دارد که فلور میکروبی روده نقش محافظت کننده‌ای در برابر بیماری های مختلف از خود نشان می‌دهد. فلور میکروبی روده حاوی بیش از صد تریلیون باکتری زنده است که به انواع مفید، مضر و خنثی برای سلامتی انسان تقسیم می‌شوند. در یک فرد سالم بین باکتری‌های مفید و مضر توازن وجود دارد، اما بسیاری از عوامل مثل استفاده از آنتی بیوتیک¬ها برای درمان بیماری‌ها، اشعه درمانی، آب درمانی، شیمی درمانی، استفاده از آب کلردار، غذاهای حاوی ترکیبای دارویی و استفاده از الکل، حساسیت¬های غذایی، عمل جراحی، آسیب‌های فیزیکی، استرس¬های شدید، توکسین¬های محیطی و حساسیت‌های ژنتیکی می¬تواند سبب از بین رفتن میکروب¬های مفید موجود در بدن فرد شود و با غالب شدن میکروب‌های مضر در روده، فرد دچار امراض و بیماری¬هایی مثل اسهال، پوکی استخوان، افزایش کلسترول خون، کاهش قدرت پاسخ گویی بدن به تحریکات خارجی و غیره خواهد شد. با مصرف پروبیوتیک¬ها، کلنی¬های مفیدی ایجاد می¬شوند که می¬توانند مانند محیط باکتریایی طبیعی روده به سلامتی انسان کمک کنند و در عین حال زمانی را فراهم آورند که محیط باکتریایی طبیعی روده، خود را ترمیم و بازسازی کند و سپس این کلنی¬ها به تدریج توسط محیط باکتریایی طبیعی روده که خود را بازسازی کرده است، جایگزین خواهند شد. از این رو پروبیوتیک‌‌ها را ترمیم کننده‌‌های زیستی می‌نامند. پروبیوتیک‌ها نیز با تعدیل باکتری¬های دستگاه گوارش و سیستم ایمنی سیستمیک در پیشگیری یا درمان سرطان پستان نقش ایفا می‌‌کنند (24,¬25). در تحقیق حاضر خاصیت ضد تکثیری سوپرناتانت باکتری لاکتوباسیلوس ساکئی بر سلول‌های سرطانی پستان که از طریق القاء مرگ برنامه‌‌ریزی شده سلولی اعمال می¬گردد، در سلول¬های رده¬ی MCF-7، مورد بررسی قرار گرفت. در این تحقیق توان زیستی سلول‌های تحت تیمار با سوپرناتانت لاکتوباسیلوس ساکئی از طریق کیت MTT مورد ارزیابی قرار گرفت. بدین صورت که سلول¬ها برای مدت زمان 24، 48 و 72 ساعت تحت تاثیر غلظت‌های مختلف سوپرناتانت لاکتوباسیلوس ساکئی انکوبه شدند و غلظتی از دارو که سبب کاهش 50 درصدی بقای سلولی می-شود، محاسبه گردید. نتایج حاصل شده از این تست حاکی از آن می‌‌باشد که سوپرناتانت لاکتوباسیلوس ساکئی قادر است رشد سلول¬های سرطانی پستان را در دوز 5 میلی¬ گرم/ میلی-لیتر به پایین‌ترین مقدار خود رساند. به علاوه در این تحقیق توانایی سوپرناتانت لاکتوباسیلوس ساکئی در تغییر بیان ژن-های رمزکننده پروتئین¬های پروآپوپتوزی و آنتی‌‌آپوپتوزی دخیل در مسیر مرگ سلولی در سلول¬های رده MCF-7 سرطان پستان، مورد بررسی قرار گرفت. در این تحقیق تیمار سلول¬های MCF-7 سرطان پستان، با دوز 5 میلی‌گرم/ میلی-لیتر سوپرناتانت لاکتوباسیلوس ساکئی و انکوباسیون آن برای مدت 72 ساعت، افزایش معنی¬دار میزان بیان ژن(p-value=0/0033) BAX  و کاهش معنی¬دار میزان بیان ژن(p-value=0/0278) BCL-2  را نشان داد. به طور مشابه تاکنون مطالعات متعددی در شرایط آزمایشگاهی و حیوانی برای بررسی اثر پروبیوتیک¬ها بر سرطان پستان انجام شده است (26). برای مثال، تجویز خوراکی لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس هر روز از دو هفته قبل از پیوند تومور سرطان پستان و 30 روز پس از پیوند با فواصل 3 روزه ادامه یافت. نتایج افزایش قابل توجهی را در مدت بقا گروه لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در مقایسه با گروه کنترل نشان داد که بیانگر آنست که این درمان می‌تواند پاسخ‌های ایمنی را از طریق تحریک تولید سایتوکین‌های پیش التهابی مانند IFN-γ و مهار تولید سیتوکین‌های ضد التهابی مانند IL-4 و IL-10 افزایش دهد. مطالعات حیوانی نیز تایید کرد که تجویز خوراکی لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس فعالیت ضد سرطانی را در موش‌های حامل تومور پستان نشان می‌دهد (27). در مطالعه دیگری، نیم میلی¬لیتر از سوسپانسیون حاوی لاکتوباسیلوس کازئی به صورت خوراکی با استفاده از لوله تغذیه معده استاندارد به موش‌ها خورانده شد. سوسپانسیون روزانه به مدت دو هفته متوالی قبل از پیوند زیر جلدی تومور آدنوکارسینومای پستان به موش داده شد. سپس تزریق به مدت سه هفته با فاصله 3 روزه بین هر هفته ادامه یافت. تجزیه و تحلیل داده ها کاهش معنی‌‌داری در سرعت رشد تومورها را نشان داد و بقا در مقایسه با گروه شاهد به‌طور قابل‌توجهی طولانی شد. مطالعه به این نتیجه رسیده است که تجویز خوراکی لاکتوباسیلوس کازئی می‌تواند بر تحریک تولید سیتوکین Th1 در کشت سلولی طحال موش و سمیت سلولی سلول NK تأثیر بگذارد (28). تجویز خوراکی شیر تخمیر شده حاوی Lactobacillus helveticus R389 یک پاسخ تنظیم کننده ایمنی را در موش‌های حامل سرطان پستان نشان داد و استفاده از آن به عنوان درمان کمکی ایمنی برای محافظت در برابر این بدخیمی پیشنهاد شده است (29). در موش‌های تحت درمان با نانوذرات سلنیوم غنی‌شده با لاکتوباسیلوس پلانتاروم، افزایش سطح IFN-γ و IL-2 گزارش شد، اما حیوانات همچنین افزایش فعالیت سلول‌های NK را نشان دادند (30). علاوه بر این، به نظر می‌رسد تجویز خوراکی نانوذرات سلنیوم غنی‌شده با لاکتوباسیلوس برویس با پیش‌آگهی بهتر بیماری در موش‌های دارای تومور پستان با متاستاتیک بالا مرتبط است (31). یک گروه اسلواکی اثربخشی ‌پیشگیرانه یک سویه باکتریایی پروبیوتیک جدید به نام Lactobacillus plantarum LS/07 را در مدل موشی برای سرطان سینه نشان دادند. Lactobacillus plantarum LS/07 روزانه و تا پایان آزمایش (16 هفته) تجویز شد. درمان با این پروبیوتیک به طور قابل توجهی تومور را سرکوب کرد، سلول¬های Cd8 + T را در بافت تومور افزایش داد و TNF-α و سطح سلول¬های Cd8 + T را در خون کاهش داد (32).  
نتیجه‌گیری
نتایج حاصل از تست MTT و RT-Real Time PCR صورت گرفته در تحقیق حاضر، بیانگر این مسئله می¬باشد که سوپرناتانت تولید شده توسط  لاکتوباسیلوس ساکئی قادر است از طریق تاثیرگذاری بر مسیر مرگ برنامه¬ریزی شده سلولی، آپوپتوز را در سلول¬های سرطانی پستان انسان القاء نماید و از این طریق در درمان سرطان پستان مؤثر واقع گردند. پیشنهاد می¬گردد که سایر محققان تاثیر سوپرناتانت تولید شده توسط لاکتوباسیلوس ساکئی را در سطح بافت روی نمونه¬های بیوپسی سرطان پستان نیز سنجش نمایند.
سپاس‌گزاری
این مقاله حاصل پایان‌نامه تحت عنوان "بررسی اثر سوپرناتانت باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس ساکئی بر میزان بیان ژن¬های آپوپتوزی در رده سلولی MCF-7 سرطان پستان" در مقطع کارشناسی ارشد در سال 1401 دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد می‌باشد که با حمایت دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد انجام شده است.
حامی مالی: ندارد
تعارض در منافع: وجود ندارد.
ملاحظات اخلاقی
پروپوزال این تحقیق توسط دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد تایید شده است (کد اخلاق: IR.IAU.SHK.REC.1402.098).
مشارکت نویسندگان
حسین سازگار در ارائه ایده، حسین سازگار و الهام همتی در طراحی مطالعه، الهام همتی در جمع‌آوری داده‌ها، حسین سازگار و الهام همتی در تجزیه و تحلیل داده‌ها مشارکت داشته و همه نویسندگان در تدوین، ویرایش اولیه و نهایی مقاله و پاسخگویی به سوالات مرتبط با مقاله سهیم هستند.
 

 

References:
 
1-    Tuasha N, Petros B. Heterogeneity of Tumors in Breast Cancer: Implications and Prospects for Prognosis and Therapeutics. Scientifica (Cairo) 2020; 2020: 4736091.
2-    Azamjah N, Soltan-Zadeh Y, Zayeri F. Global Trend of Breast Cancer Mortality Rate: A 25-Year Study. Asian Pac J Cancer Prev 2019; 20(7): 2015-20. [Persian]
3-    Qiu J, Zhang T, Zhu X, Yang C, Wang Y, Zhou N, et al. Hyperoside Induces Breast Cancer Cells Apoptosis via ROS-Mediated NF-κB Signaling Pathway. Int J Mol Sci 2019; 21(1):131.
4-    Nøhr-Nielsen A, Bagger SO, Brünner N, Stenvang J, Lund TM. Pharmacodynamic Modelling Reveals Synergistic Interaction Between Docetaxel and SCO-101 in a Docetaxel-Resistant Triple Negative Breast Cancer Cell Line. Eur J Pharm Sci 2020; 148: 105315.
5-    Su P, Ahmad B, Zou K, Zou L. β-Elemene Enhances the Chemotherapeutic Effect of 5-Fluorouracil in Triple-Negative Breast Cancer via PI3K/AKT, RAF-MEK-ErK, and NF-κB Signaling Pathways. Onco Targets Ther 2020; 13: 5207-22.
6-    Pal S, Rakshit T. Folate-Functionalized DNA Origami for Targeted Delivery of Doxorubicin to Triple-Negative Breast Cancer. Front Chem 2021; 9: 721105.
7-    Shimanuki Y, Shimomura A, Yoshimura K, Terakado H, Shimizu C. Are Platinum Drugs Ineffective for Triple-Negative Breast Cancer with Residual Invasive Disease after Neoadjuvant Chemotherapy? J Clin Oncol 2021; 39(31): 3521-3522.
8-    Yuan L, Cai Y, Zhang L, Liu S, Li P, Li X. Promoting Apoptosis, a Promising Way to Treat Breast Cancer with Natural Products: A Comprehensive Review. Front Pharmacol 2022; 12: 801662.
9-    Suraweera CD, Hinds MG, Kvansakul M. Poxviral Strategies to Overcome Host Cell Apoptosis. Pathogens 2020; 10(1): 6.
10-    Roos WP, Kaina B. DNA Damage-Induced Cell Death: From Specific DNA Lesions to the DNA Damage Response and Apoptosis. Cancer Lett 2013; 332(2): 237-48.
11-    Rajabi S, Maresca M, Yumashev AV, Choopani R, Hajimehdipoor H. The Most Competent Plant-Derived Natural Products for Targeting Apoptosis in Cancer Therapy. Biomolecules 2021; 11(4): 534. [Persian]
12-    Thu MS, Ondee T, Nopsopon T, Farzana IAK, Fothergill JL, Hirankarn N, et al. Effect of Probiotics in Breast Cancer: A Systematic Review and Meta-Analysis. Biology (Basel) 2023; 12(2): 280.
13-    Garbacz K. Anticancer Activity of Lactic Acid Bacteria. Semin Cancer Biol 2022; 86(3): 356-66.
14-    Zhong L, Zhang X, Covasa M. Emerging Roles of Lactic Acid Bacteria in Protection Against Colorectal Cancer. World J Gastroenterol 2014; 20(24): 7878-86.
15-    Ji Y, Park S, Chung Y, Kim B, Park H, Huang E, et al. Amelioration of Obesity-Related Biomarkers by Lactobacillus Sakei CJLS03 in a High-Fat Diet-Induced Obese Murine Model. Sci Rep 2019; 9: 6821.
16-    Rather IA, Bajpai VK, Ching LL, Majumder R, Nam GJ, Indugu N, et al. Effect of a Bioactive Product SEL001 from Lactobacillus Sakei Probio65 on Gut Microbiota and Its Anti-Colitis Effects in a TNBS-Induced Colitis Mouse Model. Saudi J Biol Sci 2019; 27: 261-70.
17-    Bajpai VK, Rather IA, Park YH. Partially Purified Exo-Polysaccharide from Lactobacillus Sakei Probio 65 with Anti-oxidant, α-Glucosidase and Tyrosinase Inhibitory Potential. J Food Biochem 2016; 40: 264-74.
18-    Kim SY, Shin JS, Chung KS, Han HS, Lee HH, Lee JH, et al. Immunostimulatory Effects of Live Lactobacillus Sakei K040706 on the CYP-Induced Immunosuppression Mouse Model. Nutrients 2020; 12(11): 3573.
19-    De Carvalho KG, Bambirra FHS, Kruger MF, Barbosa MS, Oliveira JS, Santos AMC, et al. Antimicrobial Compounds Produced by Lactobacillus Sakei Subsp. Sakei 2a, A Bacteriocinogenic Strain Isolated from a Brazilian Meat Product. J Ind Microbiol Biotechnol 2010; 37: 381-90.
20-    Bajpai VK, Han JH, Nam GJ, Majumder R, Park C, Lim J, et al. Characterization and Pharmacological Potential of Lactobacillus Sakei 1I1 Isolated from Fresh Water Fish Zacco Koreanus. DARU J Pharm Sci 2016; 24: 1-12.
21-    Malaki MS, Rouhi L, Khashei Varnamkhasti K. Apoptotic Induction in Human Colorectal Adenocarcinoma Cell Line and Growth Inhibition of Some Gastrointestinal Pathogenic Species by Lactobacillus Sakei Metabolites. Payavard Salamat 2021; 14(6) :476-83. [Persian]
22-    Malaki MS, Rouhi L, Khashei Varnamkhasti K. Cytotoxic and Antimicrobial Effects of Lactobacillus Sakei on Human Colorectal Adenocarcinoma Cell Line (HT29) and Some Pathogenic Microorganisms. Tehran Univ Med J 2021; 78 (10): 644-50. [Persian]
23-    Varnamkhasti KK, Tavakoli P, Rouhi L, Raisi S. Cytotoxicity, Apoptosis Induction and Change of P53, PARP, P21 and Bcl-2 Genes Expression in the Human Anaplastic Thyroid Carcinoma Cells Line (SW-1736) with Curcumin. Genetics & Applications 2021; 5(1): 10-7.
24-    Rafter J. Lactic Acid Bacteria and Cancer: Mechanistic Perspective. Br J Nutr 2008; 88 (S1): 89-94.
25-    Lye HS, Kuan CY, Ewe JA, Fung WY, Liong MT. The Improvement of Hypertension by Probiotics: Effects on Cholesterol, Diabetes, Renin, and Phytoestrogens. Int J Mol Sci 2009; 10(9): 3755-775.
26-    Mendoza L. Potential Effect of Probiotics in the Treatment of Breast Cancer. Oncol Rev 2019; 13(2): 422.
27-    Yazdi MH, Soltan Dallal MM, Hassan ZM. Oral Administration of Lactobacillus Acidophilus Induces IL-12 Production in Spleen Cell Culture of BALB/C Mice Bearing Transplanted Breast Tumour. Br J Nutr 2010; 104: 227-32. [Persian]
28-    Soltan Dallal MM, Yazdi MH, Holakuyee M. Lactobacillus Casei Ssp.Casei Induced Th1 Cytokine Profile and Natural Killer Cells Activity in Invasive Ductal Carcinoma Bearing Mice. IJAAI 2012; 11(2): 183-9.
29-    de Moreno A, Matar C, LeBlanc N, Perdigon G. Effects of Milk Fermented by Lactobacillus Helveticus R389 on a Murine Breast Cancer Model. Breast Cancer Res 2005; 7: 477- 86.
30-    Yazdi MH, Mahdavi M, Kheradmand E, Shahverdi AR. The Preventive Oral Supplementation of a Selenium Nanoparticle Enriched Probiotic Increases the Immune Response and Lifespan of 4T1 Breast Cancer Bearing Mice. Arzneimittel-Forschung 2012; 62(11): 525-31. [Persian]
31-    Yazdi MH, Mahdavi M, Setayesh N, et al. Nanoparticleenriched, S. Lactobacillus Brevis Causes More Efficient Immune Responses In-Vivo and Reduces the Liver Metastasis in Metastatic form of Mouse Breast Cancer. DARU J Pharm Sci 2013; 21: 33. [Persian]
32-    Kassayova M, Bobrov N, Strojny L. Preventive Effects of Probiotic Bacteria Lactobacillus Plantarum and Dietary Fiber in Chemically Induced Mammary Carcinogenesis. Anticancer Res 2014; 34(9): 4969-76.