ماهنامه علمی پ‍ژوهشی

Original Article

Effect of Selenium on Testicular Tissue in Adult NMRI Mice Following Cyclophosphamide-Induced Toxicity

Malek Soleimani Mehranjani1 , Zahra Safari1  , Sepideh Ahmadi1  

1 Department of Biology, Faculty of Science, Arak University, Arak, Iran

 Corresponding author:
Department of Biology, Faculty of Science, Arak University, Arak, Iran

Email: 
m-soleimani@araku.ac.ir
Tel: +98 9181617098
Postal Code: 

Received: November 09, 2025
Revised: May 12, 2026
Accepted: June 10, 2026

Citation:
Soleimani Mehranjani M, Safari Z, Ahmadi S. Effect of Selenium on Testicular Tissue in Adult NMRI Mice Following Cyclophosphamide-Induced Toxicity. J Shahid Sadoughi Uni Med Sci 2026; 34(4): 10134-149.
    Introduction: Cyclophosphamide, as a chemotherapeutic drug, causes induction of oxidative stress and disruption in the testis structure and function. In this study, the effect of selenium as a strong antioxidant on the testicular tissue of male mice after treatment with cyclophosphamide was evaluated.
Methods: For this experimental study, 32 adult male NMRI mice were divided into four groups of eight: control, cyclophosphamide (100 mg/kg, administered once weekly), selenium (1 mg/kg daily for 35 days), and a combination of cyclophosphamide and selenium. Following the 35-day treatment period, the mice were dissected; the left testis was utilized to measure malondialdehyde (MDA) levels and total antioxidant capacity (TAC), while the right testis, after undergoing fixation, tissue processing, sectioning, and hematoxylin-eosin staining, was employed for stereological analyses. Data were analyzed using SPSS software, applying one-way ANOVA followed by Tukey’s post-hoc test, with statistical significance set at p<0.05.
Results: In the cyclophosphamide group compared to control, a significant decrease was observed in mean total testis volume, seminiferous tubules volume (p<0.001), interstitial tissue volume (p<0.01), as well as in the length, diameter, and height of the germinal epithelium. basement membrane thickness, number of spermatogenic, Sertoli and Leydig cells, spermatogenesis indices, Johnsen score, and TAC level of testicular tissue (p<0.001), while the MDA level significantly increased (p<0.001). In the cyclophosphamide plus selenium group, these changes were compensated at the control level.
Conclusion: The results showed that cyclophosphamide induces oxidative stress, causes disruption in the structure and function of the testis. While selenium reduced these damages and improved important histological and oxidative stress parameters to levels similar to the control group, suggesting a protective role against cyclophosphamide-induced testicular damage.

Keywords: Cyclophosphamide, Selenium, Mouse testis, Biochemical factors, Stereology.


 


مقاله پژوهشی

اثر سلنیوم بر بافت بیضه در موش‌های بالغ NMRI به دنبال القاء سمیت ناشی از سیکلوفسفامید

ملک سلیمانی مهرنجانی 1 ، زهرا صفری1  ، سپیده احمدی1  

1 گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه اراک، اراک، ایران.

 نویسنده مسئول:
ملک سلیمانی مهرنجانی 

گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه اراک، اراک، ایران.

پست الکترونیک:
 m-soleimani@araku.ac.ir
تلفن: 09181617098
صندوق پستی: 

تاریخ دریافت: 18/8/1404
تاریخ بازنگری: 22/02/1405
تاریخ پذیرش: 20/03/1405

ارجاع: 
سلیمانی مهرنجانی ملک، صفری زهرا، احمدی سپیده. اثر سلنیوم بر بافت بیضه در موش‌های بالغ NMRI به دنبال القاء سمیت ناشی از سیکلوفسفامید. مجله علمی پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد 1404؛ 34 (4): 149-10134.        مقدمه: سیکلوفسفامید ‌به‌عنوان یک داروی شیمی‌درمانی باعث القا استرس اکسیداتیو و اختلال در ساختار و عملکرد بیضه می‌شود. در این مطالعه اثر سلنیوم به‌عنوان یک آنتی‌اکسیدانت قوی بر بافت بیضه‌ موش‌های نر پس از تیمار با سیکلوفسفامید ارزیابی شد.
روش بررسی: در این مطالعه تجربی، 32 سر موش نر بالغ NMRI در چهار گروه (8=n) شامل کنترل، سیکلوفسفامید (100 میلی‌گرم/کیلوگرم، هفته‌ای یک‌بار)، سلنیوم (1 میلی‌گرم/کیلوگرم روزانه به‌مدت 35 روز) و سیکلوفسفامید + سلنیوم تقسیم شدند. پس از 35 روز تیمار، موش‌ها تشریح شدند؛ بیضه چپ برای سنجش مالون‌دی‌آلدئید (MDA) و ظرفیت آنتی‌اکسیدانتی کل (TAC) و بیضه راست پس از فیکساسیون، پاساژ بافتی، برش‌گیری و رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین برای بررسی‌های استریولوژیک استفاده شد. داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار نسخه 16 SPSS، آزمون ANOVA یک‌طرفه و تست Tukey تحلیل شدند (05/0>p).
نتایج: در گروه سیکلوفسفامید نسبت به گروه کنترل، کاهش معنی‌دار میانگین حجم کل بیضه، حجم لوله¬های منی¬ساز (001/0>p)، حجم بافت بینابینی (01/0>p)، طول، قطر، ارتفاع اپیتلیوم زایشی، ضخامت غشاء پایه، تعداد سلول¬های اسپرماتوژنیک، سرتولی و لیدیگ، شاخص¬های اسپرماتوژنز، امتیاز جانسن و سطح TAC بافت بیضه (001/0>p) مشاهده شد، اما سطح MDA به‌طور معنی¬داری افزایش یافت (001/0>p). در گروه سیکلوفسفامید + سلنیوم، این تغییرات در سطح گروه کنترل جبران شد. 
نتیجه‌گیری: نتایج نشان داد که سیکلوفسفامید با القاء استرس اکسیداتیو موجب اختلال در ساختار و عملکرد بیضه می‌شود. در حالی‌که سلنیوم این آسیب‌ها را کاهش داد و پارامترهای مهم بافت‌شناسی و اکسیداتیو را تا سطح گروه کنترل جبران کرد، که نشان‌دهنده اثر محافظتی آن بر بافت بیضه تیمار شده با سیکلوفسفامید است.
واژه‌های کلیدی: سیکلوفسفامید، سلنیوم، بیضه موش، فاکتورهای بیوشیمیایی، استریولوژی



 

مقدمه
سیکلوفسفامید یکی از رایج¬ترین داروهای شیمی¬درمانی است و به‌عنوان یک عامل آلکیله¬کننده، در درمان انواع سرطان‌ها، بیماری¬های خودایمنی و همچنین برای جلوگیری از رد پیوند تجویز می¬شود (1). مکانیسم عملکرد عوامل آلکیله‌کننده‌ای مانند سیکلوفسفامید بر ایجاد اتصال متقابل در رشته‌های DNA استوار است که موجب اختلال در رشد سلولی، فعالیت میتوزی، تکثیر و تمایز سلول‌ها می‌شود. این عملکرد، اساس اثرات درمانی سیکلوفسفامید را تشکیل می‌دهد، اما در عین حال منشأ اثرات سمی آن نیز می‌باشد. به همین دلیل این دارو می‌تواند بر سلول‌های طبیعی در حال تقسیم، به‌ویژه سلول‌هایی با سرعت تقسیم بالا مانند سلول‌های جنسی، اثرات سمی قابل‌توجهی ایجاد کند (2،3،4). در همین راستا، گزارش‌هایی مبنی بر اثر سیکلوفسفامید در کاهش باروری مردان، کاهش وزن بیضه¬ها و تغییرات پاتولوژیک در این اندام و نیز افزایش وقوع الیگواسپرمی و آزواسپرمی، در مردان درمان شده با سیکلوفسفامید، وجود دارد (2،5،6). یکی از عوارض سمی سیکلوفسفامید، ایجاد شرایط استرس اکسیداتیو از طریق تأثیر بر پروتئین‌ها و مولکول‌های کلیدی دخیل در حفاظت سلول در برابر آسیب‌های اکسیداتیو است. از جمله‌ی این عوامل می‌توان به سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون و ویتامین‌های E و C اشاره کرد که سیکلوفسفامید با کاهش سطح آن‌ها موجب افزایش استرس اکسیداتیو و در نهایت آسیب به بافت بیضه می‌شود (8، 7). همچنین سیکلوفسفامید باعث کاهش میزان آنزیم گلوکز-۶-فسفات دهیدروژناز می‌گردد؛ آنزیمی که در تولید (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate) NADPH نقش داشته و برای بازسازی گلوتاتیون ضروری است (9). علاوه بر این، سیکلوفسفامید موجب کاهش سطح Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) می‌شود (2)؛ پروتئینی کلیدی که با تنظیم تولید آنتی‌اکسیدانت‌ها و هماهنگ‌سازی عملکرد سایر پروتئین‌های محافظ، در کاهش سطح گونه‌های فعال اکسیژن (Reactive Oxygen Species: ROS) و حفظ تعادل سلولی در برابر استرس اکسیداتیو نقش اساسی دارد (10). سلنیوم یک عنصر کمیاب ضروری است که در ساختار برخی آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانتی نقش دارد و در دفاع سلول در برابر استرس اکسیداتیو مؤثر است. این عنصر جزء اصلی آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز بوده و به تبدیل پراکسید هیدروژن و پراکسیدهای چربی به مولکول‌های پایدارتر کمک می‌کند. در نتیجه، این فرآیند از پراکسیداسیون لیپیدها جلوگیری کرده و از غشای سلولی و اندامک‌های درون سلول در برابر آسیب اکسیداتیو محافظت می‌کند (11،12). نتایج مطالعات Mohammadpour و همکاران در سال 2021 درباره اثر حفاظتی سلنیوم و ویتامین E بر اسپرماتوژنز در موش‌های صحرایی مقاوم به انسولین نشان داد که سلنیوم به‌عنوان یک عنصر حیاتی در بافت بیضه شناخته می‌شود و نقش ضروری در فرآیند اسپرماتوژنز و باروری مردان ایفا می‌کند (13). همچنین نتایج پژوهش Apaydin و همکاران در سال 2014 روی موش نشان داد که سلنیت سدیم نقش محافظتی قابل‌توجهی در کاهش سمیت بیضه ناشی از نیترات سرب در موش‌های دیابتی و غیردیابتی دارد (14). علاوه بر این، در مطالعه Mahrous و همکاران (2020) یافته‌ها بیانگر آن بود که سلنیوم موجب کاهش سطح مالون‌دی‌آلدئید (MDA)، افزایش سطح سرمی هورمون محرک فولیکول (FSH) و هورمون لوتئینه‌کننده (LH)، بهبود ویژگی‌های هیستوپاتولوژیک بیضه و همچنین جلوگیری از کاهش وزن بیضه می‌شود (15). با توجه به اینکه تجویز سیکلوفسفامید در مردان مبتلا به سرطان می‌تواند موجب اختلالات باروری شود و اثر همزمان سلنیوم و این دارو بر بافت بیضه با استفاده از تکنیک استریولوژی تاکنون بررسی نشده است، در این مطالعه اثر سلنیوم به‌عنوان یک ریزمغذی ضروری با خاصیت آنتی‌اکسیدانتی قوی، بر شاخص‌های بیوشیمیایی و تغییرات استریولوژیک بافت بیضه در موش‌های نر بالغ نژاد NMRI تیمار شده با سیکلوفسفامید مورد بررسی قرار گرفت.
روش بررسی
گروه‌بندی و روش تیمار حیوانات: در این مطالعه تجربی،32 سر موش نر بالغ نژاد NMRI با میانگین وزنی 2±36 گرم (6 هفته‌ای) از خانه حیوانات دانشگاه اراک تهیه شد و سپس در طول مدت تیمار، در شرایط کاملا استاندارد (دمای 2±21 درجه سانتی¬گراد و نور محیطی با شرایط 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی) و دسترسی آزاد به آب و غذا، در خانه حیوانات دانشگاه اراک نگهداری شد. موش¬ها پس از توزین، به¬صورت کاملا تصلادفی، به 4 گروه (8=n) تقسیم شدند: گروه کنترل، گروه سیکلوفسفامید (سیکلوفسفامید منوهیدرات، شرکت سیگما، آلمان، Cat. No. C0768) (100 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن، هفته‌ای یکبار، اول هر هفته به‌مدت 5 هفته) (18-16)، گروه سلنیوم (سلنیت سدیم، شرکت سیگما، آلمان، Cat. No. 6214485) (1 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن، روزانه به‌مدت 35‌ روز) (19،20) و گروه سیکلوفسفامید + سلنیوم. تیمارها به‌صورت تزریق درون صفاقی انجام شد.
تشریح موش¬ها: پس از تمام شدن دوره 35 روزه تیمار و وزن‌کشی نهایی (وزن ثانویه)، موش¬ها با استفاده از مواد کتامین (100 mg/kg; ketamine 10%, Alfasan, Woerden, the Netherlands) و زایلازین (10 mg/ kg; xylazine 2%, Alfasan, Woerden, and the Netherlands) بیهوش شدند. با ایجاد شکاف در اسکروتوم، بیضه چپ به‌منظور اندازه‌گیری میزان MDA و ظرفیت آنتی‌اکسیدانتی کل (TAC) بافت و بیضه راست به منظور بررسی¬های استریولوژیک، از بدن جدا شد. حجم کل بیضه به روش غوطه‌ورسازی محاسبه شد، بدین منظور یک بشر حاوی آب مقطر بر روی ترازو قرار گرفت و سپس ترازو را صفر کرده و در ادامه بافت بیضه توسط یک نخ نازک، آویزان شده و کاملاً غوطه‌ور گردید. پس از آن عدد نشان داده شده توسط ترازو، به‌عنوان حجم بیضه بر حسب سانتی‌متر مکعب در نظر گرفته شد. به‌عبارت دیگر در این مرحله حجم کل بیضه قبل از چروکیدگی بافت، محاسبه گردید (17). بیضه راست به¬‌منظور بررسی¬های استریولوژیک پس از توزین به داخل فیکساتیو (Modified Davidson’s Fluid)  MDFانتقال داده شد و به‌مدت یک هفته در دمای آزمایشگاه نگهداری گردید (17) و سپس برش‌های IUR (Isotropic uniform random sampling) از بافت بیضه گرفته شد. پس از طی نمودن مراحل پاساژ بافت، بلوک¬گیری با پارافین مذاب انجام شد و توسط دستگاه میکروتوم برش¬هایی به ضخامت¬های 5 و 20 میکرون، از نمونه¬های بافتی تهیه شد و در نهایت رنگ‌آمیزی برش¬ها با روش هماتوکسیلین-ائوزین (مرک، آلمان) صورت گرفت.
محاسبه چروکیدگی بافت بیضه: به‌منظور اندازه‌گیری چروکیدگی بافت، سه قطعه گرد از برش‌های موبوط به بافت بیضه هر موش تهیه و 2 قطر عمود برهم این قطعات، توسط کولیس ورنیه، اندازه‌گیری شد و میانگین شعاع آن‌ها به¬عنوان شعاع قبل از چروکیدگی (r-before) در نظر گرفته شد. پس از طی مراحل پاساژ بافتی و بلوک¬گیری، از هر قطعه، 3 برش 5 میکرونی توسط دستگاه میکروتوم گرفته و پس از رنگ‌آمیزی، مجددا 2 قطر عمود برهم این قطعات، توسط کولیس ورنیه اندازه‌گیری شده و میانگین شعاع آن‌ها به¬عنوان شعاع بعد از چروکیدگی (r-after) لحاظ گردید. میزان چروکیدگی بافت بیضه به‌صورت زیر محاسبه شد:
Shirinkage= 1-〖(〖r after〗^2/〖r before〗^2 )〗^(3/2)
حجم کل بافت بیضه بعد از چروکیدگی از طریق ضرب مقدار عدم چروکیدگی در حجم کل بیضه قبل از چروکیدگی (حجمی که به روش غوطه‌ورسازی به‌دست آمد) محاسبه شد (21).
تخمین حجم بافت بینابینی و لوله¬های منی¬ساز: به منظور تخمین حجم لوله‌های منی‌ساز و بافت بینابینی، با استفاده از روش نمونه‌گیری تصادفی سیستماتیک به‌طور میانگین پنج میدان دید با فاصله¬ یکسان، از هر برش 5 میکرونی با میکروسکوپ مدل Olympus BX41TE تجهیز شده به دوربین عکس¬برداری مدل  Olympus (DP12)و نرم‌افزار Olysia انتخاب گردید. سپس با قرار دادن پروب نقطه¬ای به¬طور تصادفی و بدون سوگیری روی تصاویر مقاطع بافتی در هر میدان، کلیه¬ نقاط برخوردی پروب با هر میدان دید (∑_(i=1)^n▒〖P(total)〗) و سپس نقاط برخورد کرده با لوله¬های منی¬ساز و بافت بینابینی (∑_(i=1)^n▒〖P(structure)〗) به‌صورت مجزا شمارش شد. دانسیته¬ حجمی هر یک از اجزا براساس فرمول زیر محاسبه گردید:

Vv(Structure)=(∑_(i=1)^n▒〖P(structure)〗)/(∑_(i=1)^n▒〖P(total)〗)
در نهایت به منظور محاسبه حجم نهایی لوله¬های منی¬ساز و بافت بینابینی، دانسیته حجمی به¬دست آمده برای هر یک از ساختارهای فوق، در حجم کل بیضه ضرب گردید (21).
تخمین طول لوله¬های منی¬ساز: جهت تخمین طول لوله¬های منی¬ساز، پنج میدان دید تصادفی از هر برش 5 میکرونی، با استفاده از ob10 میکروسکوپ مورد بررسی قرار گرفت. سپس، پروب مخصوص شمارش به¬صورت تصادفی روی تصاویر حاصل از میدان¬های دید انتخابی، قرار گرفته و در هر میدان دید، به‌طور میانگین 200-100 لوله منی¬ساز که با خطوط ممنوعه تماس نداشته مورد شمارش قرار گرفت و به¬عنوان ƩQi لحاظ گردید. در ادامه دانسیته طولی لوله¬های منی¬ساز با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد:
Lv=2×(∑_(i=1)^n▒Qi)/(a/f ×∑_(i=1)^n▒Pi)
که در آن، :∑_(i=1)^n▒Qi مجموع لوله¬های منی¬ساز انتخاب شده و شمارش¬شده، : a/f سطح فریم در مقیاس واقعی بافت و :∑_(i=1)^n▒Pi  مجموع نقاط برخورد کرده با تصویر بیضه است. سپس طول لوله¬های منی¬ساز با ضرب دانسیته طولی در حجم نهایی بیضه به‌دست آمد (17).
تخمین قطر لوله¬های منی¬ساز: جهت تخمین قطر لوله¬های منی¬ساز، با استفاده از میکروسکوپ نوری با بزرگ‌نمایی 10x، از هر برش 5 میکرونی، 5 میدان دید مورد بررسی قرار گرفت. سپس پروب صلیب ¬مانند به¬گونه¬ای روی لوله¬های انتخاب شده انداخته شد که طول بلند صلیب در راستای طولی لوله¬های منی‌ساز و قطر کوچک آن در امتداد قطر کوچک لوله¬ها قرار گرفت؛ نهایتا قطر کوچک 200 -100 لوله منی¬ساز را با استفاده از نرم¬افزار موتیک اندازه¬گیری و میانگین آن‌ها به‌عنوان قطر لوله¬های منی¬ساز در نظر گرفته شد (17).
تخمین ارتفاع اپیتلیوم زایشی
به منظور تخمین ارتفاع اپیتلیوم زایشی، روی تصاویر حاصله از هر میدان دید، پروب مخصوص سطح انداخته شد و به¬طور میانگین 200-100 نقطه برخورد کرده با کل بافت بیضه، شمارش گردید. در ادامه نقاط برخوردی با اپیتلیوم زایشی، و نیز نقاط برخورد کرده با سطح لومنی اپیتلیوم زایشی، به¬طور جداگانه شمارش شد. سپس با تقسیم کل نقاط برخورد کرده با اپیتلیوم زایشی (∑_(i=1)^n▒〖P epitelium〗) بر کل نقاط برخورد کرده با بافت بیضه، دانسیته¬ حجمی اپیتلیوم زایشی (Vv)، براساس فرمول زیر محاسبه گردید:
Vv(epitelium)=(∑_(i=1)^n▒〖P epitelium〗)/(∑_(i=1)^n▒〖P total〗)
دانسیته¬ سطحی اپیتلیوم زایشی (Sv) نیز با استفاده از فرمول زیر به¬دست آمد:
Sv=2×(∑_(i=1)^n▒Ii)/(I/p×∑▒Pi)
که در آن، :∑▒I مجموع نقاطی از پروب که با سطح لومنی اپیتلیوم زایشی برخورد کرده‌اند، :∑▒P مجموع نقاط برخوردی با بافت بیضه و :I/p طول هر خط پروب بر هر نقطه در مقیاس واقعی بافت می‌باشد.
در نهایت با قراردادن Sv و Vvدر فرمول  H=Vv/Sv، ارتفاع اپیتلیوم زایشی لوله¬های منی¬ساز محاسبه گردید (17).
تخمین ضخامت غشاء پایه¬ لوله¬های منی¬ساز: برای تخمین میانگین ضخامت غشاء پایه لوله¬های منی¬ساز از روش اندازه‌گیری هارمونیک استفاده شد. ابتدا، پروب مخصوص که دارای 3 خط موازی است به‌صورت تصادفی، روی تصاویر گرفته شده از میدان‌های دید انتخابی انداخته شد. از نقطه برخورد خطوط پروب با سطح داخلی غشاء پایه، خطی عمود بر مماس سطح خارجی غشاء رسم کرده و با استفاده از نرم‌افزار موتیک طول این خط اندازه¬گیری گردید که¬ به¬عنوان Oi لحاظ گردید (شکل 1). برای بیضه هر موش به‌طور میانگین 100 الی 200 برخورد اندازه‌گیری شد. در نهایت با استفاده از فرمول زیر میانگین ضخامت غشاء پایه¬ لوله¬های منی¬ساز محاسبه گردید (22):
(number of measurments)/(sum of the reciprocal intercept lenght)×= 8π/3ضخامت غشاء پایه

sum of the reciprocal intercept lenght=1/Oi1+1/Oi2+1/Oi3+1/Oi4+⋯  




شکل 1: روش اندازه‌گیری ضخامت غشاء پایه
ابتدا پروب اندازه¬گیری ضخامت غشاء پایه به¬طور کاملا تصادفی، روی میدان دید انتخابی انداخته شد. سپس از نقطه برخورد خطوط پروب با سطح داخلی غشاء پایه، خطی عمود (با رنگ قرمز) بر مماس سطح خارجی غشاء (با رنگ زرد) رسم کرده و سپس اندازه آن گرفته شد (رنگ¬¬‌آمیزی H&E، بزرگنمایی100×).

 تخمین تعداد سلول¬های اسپرماتوژنیک (اسپرماتوگونی، اسپرماتوسیت، اسپرماتید گرد و کشیده)، سرتولی و لیدیگ: به‌منظور تخمین تعداد سلول¬های اسپرماتوژنیک، سرتولی و لیدیگ، از روش اپتیکال دایسکتور، فریم مخصوص شمارش و دستگاه میکروکیتور مدل (ND 221 B, Heidenhain, Germany)  استفاده گردید. برای این منظور، با استفاده از ob100 میکروسکوپ نوری، به‌طور تصادفی، تعدادی از میدان-های دید برش¬های با ضخامت 20 میکرونی مورد بررسی قرار گرفتند. در هر میدان دید، از دو ناحیه¬ حفاظت شده به ضخامت 5 میکرون از بالا و پایین برش، به¬دلیل وجود آرتیفکت¬های احتمالی صرف نظر گردید. پس از آن، به‌میزان 10 میکرون در جهت محور z، در عمق بافت پیش رفته و در حین حرکت در عمق برش، تمام انواع سلول¬هایی که در فریم شمارش انتخاب شدند، مورد شمارش قرار گرفتند. ملاک انتخاب، سلول‌هایی بودند که هسته‌ آن‌ها در حالت فوکوس در داخل فریم شمارش قرار گرفته و با خطوط ممنوعه برخورد نکرده بود. سپس به‌منظور تخمین دانسیته¬¬ عددی انواع سلول-ها، از فرمول زیر استفاده گردید:
Nv=(∑_(i=1)^n▒Qi)/(h×∑_(n=1)^n▒〖Pi×a/f〗)
که در آن، :∑_(i=1)^n▒Qi مجموع تعداد سلول¬های شمارش شده، :h ارتفاعی از برش که شمارش سلول¬ها در آن انجام شد، :∑_(n=1)^n▒Pi مجموع نقاط برخورد کرده با میدان¬های دید انتخابی و :a/f سطح فریم در مقیاس واقعی بافت است. 
در نهایت با ضرب دانسیته عددی در حجم کل بیضه، تعداد کل هر یک سلول¬های مورد نظر محاسبه شد (23).
ارزیابی شاخص¬های اسپرماتوژنز: به¬طور کلی، 100 مقطع لوله منی¬ساز گرد، از برش¬های 5 میکرونی بافت بیضه در هر موش، به‌طور تصادفی در زیر میکروسکوپ نوری با ob40 انتخاب گردید. سپس شاخص‌های اسپرم‌زایی شامل شاخص ضریب تمایز لوله‌ای، شاخص اسپرم‌زایی، شاخص میوزی و شاخص سلول سرتولی محاسبه گردید. جهت تعیین شاخص ضریب تمایز لوله‌ای، درصد لوله‌های اسپرم‌ساز حاوی حداقل سه رده سلول زایای تمایز یافته محاسبه شد. برای ارزیابی شاخص اسپرم‌زایی، لوله¬های حاوی اسپرماتوزوآ در لومن، به-عنوان اسپرمیوژنز مثبت و لوله¬های فاقد اسپرماتوزوآ در لومن، به¬عنوان اسپرمیوژنز منفی درنظر گرفته شدند و در نهایت نتیجه به‌صورت درصد لوله¬های دارای اسپرمیوژنز مثبت، گزارش شد. جهت سنجش شاخص میوزی، نسبت مجموع اسپرماتیدهای گرد به مجموع اسپرماتوسیت¬های اولیه¬ در 100 لولۀ منی¬ساز، محاسبه شد. به‌منظور تخمین شاخص سلول سرتولی، نسبت تعداد کل اسپرماتوگونی‌ها و اسپرماتوسیت‌ها به مجموع تعداد سلول‌های سرتولی در 100 لوله منی¬ساز، محاسبه گردید (21). همچنین اسپرماتوژنز در لوله‌های اسپرم‌ساز با استفاده از سیستم امتیازدهی جانسن، مطابق با جدول 1 ارزیابی شد (17):
 

جدول 1: سیستم امتیازدهی جانسن.


 
اندازه‌گیری سطح MDA و TAC بیضه: میزان MDA بافت بیضه با کیت Nalondi™-Lipid Peroxidation Assay Kit-MDA, Cat. No. NS-15022 (شرکت نوند سلامت، ایران) با روش تیوباربیتوریک‌اسید اندازه‌گیری شد. طبق پروتکل ارائه شده توسط کیت، محلول کاری تهیه شد و ۸۰۰ میکرولیتر از آن با ۲۰۰ میکرولیتر نمونه مخلوط گردید. مخلوط حاصل در دمای ۹۵ درجه سانتی‌گراد به‌مدت ۴۵ دقیقه حرارت داده شد. پس از رسیدن به دمای اتاق، نمونه‌ها سانتریفیوژ شدند (۱۵ دقیقه، ۳۰۰۰ دور در دقیقه) و جذب نوری مایع رویی توسط دستگاه اسپکتروفتومتری در طول موج ۵50 نانومتر خوانده شد. میزان TAC بافت بیضه با استفاده از کیت Naxifer™-Total Antioxidant Capacity Assay Kit-TAC, Cat. No. NS-15012 (شرکت نوند سلامت، ایران) و براساس روش (Ferric Reducing Antiioxidant Power) FRAP سنجیده شد. برای این منظور، 250 میکرولیتر از محلول کار آماده شده به 5 میکرولیتر از نمونه اضافه شد و جذب نوری نمونه‌ها پس از 5 دقیقه توسط دستگاه اسپکتروفتومتری در طول موج 593 نانومتر خوانش شد. در نهایت، با استفاده از نرم‌افزار اکسل، نمودار منحنی استاندارد براساس جذب¬های به¬دست¬آمده رسم گردید و براساس معادله¬ خط حاصل از نمودار، میزان MDA و TAC بافت محاسبه شد (24،25). 
تجزیه و تحلیل آماری
داده¬ها توسط نرم‌افزارversion 16  SPSS و روش آنالیز واریانس یک‌طرفه و آزمون توکی مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت و تفاوت میانگین¬ها در سطح 05/0>p معنادار درنظر گرفته شد.
تغییرات هیستوپاتولوژیک بافت بیضه: بیضه و لوله¬های منی¬ساز در گروه کنترل، بافت‌شناسی طبیعی را نشان دادند (شکل2A). این در حالی بود که مطالعات بافت‌شناسی در گروه سیکلوفسفامید، ظاهر غیرطبیعی در بافت بیضه از جمله آتروفی لوله‌های منی‌ساز، گسترش فضای بین‌لوله‌ای، کاهش ضخامت اپیتلیوم زایشی و همچنین واکوئله‌شدن و دژنراسیون اپیتلیوم ژرمینال را آشکار کرد (شکل2B). در گروه سیکلوفسفامید + سلنیوم، لوله¬های منی¬ساز و اپیتلیوم زایشی، ساختاری منظم و طبیعی¬تر پیدا کردند و نمای بافت نیز نسبت به گروه سیکلوفسفامید بهبود یافته بود (شکل2C)؛ در گروه سلنیوم نیز، بیضه و لوله¬های منی¬ساز، نمایی مشابه با گروه کنترل داشتند (شکل2D).
حجم کل بیضه، حجم لوله¬های منی¬ساز و حجم بافت بینابینی: میانگین حجم کل بیضه، حجم لوله¬های منی¬ساز (001/0>p) و حجم بافت بینابینی (01/0>p) در گروه سیکلوفسفامید نسبت به گروه کنترل، کاهش معنی¬داری را نشان داد. افزایش معنی¬داری در میانگین حجم کل بیضه، حجم لوله‌های منی¬ساز و حجم بافت بینابینی در گروه سیکلوفسفامید+ سلنیوم نسبت به گروه سیکلوفسفامید دیده شد (05/0>p) و این افزایش به سطح گروه کنترل رسید (05/0<p). در گروه سلنیوم نسبت به گروه کنترل، در هیچ¬یک از پارامترهای ذکرشده، تفاوت معنی¬داری دیده نشد (05/0<p) (جدول 2).
میانگین طول، قطر، ضخامت غشاء پایه و ارتفاع اپیتلیوم زایشی لوله¬های منی¬ساز: کاهش معنی‌داری در میانگین طول، قطر، ضخامت غشاء پایه‌ و ارتفاع اپیتلیوم زایشی لوله¬های منی‌ساز در گروه سیکلوفسفامید نسبت به گروه کنترل مشاهده شد (001/0>p). در گروه سیکلوفسفامید + سلنیوم، افزایش معنی‌داری در میانگین طول (01/0>p)، قطر، ضخامت غشاء پایه و ارتفاع اپیتلیوم زایشی لوله¬های منی¬ساز (001/0>p) در مقایسه با گروه سیکلوفسفامید دیده شد. به‌طوری‌که قطر لوله‌های منی‌ساز و ضخامت غشاء پایه لوله‌های منی‌ساز به سطح گروه کنترل رسید (05/0<p). هیچ¬یک از پارامترهای ذکرشده در گروه سلنیوم نسبت به گروه کنترل، تفاوت معنی‌داری را نشان نداد (05/0<p) (جدول 3).
میانگین تعداد سلول¬های اسپرماتوگونی، اسپرماتوسیت، اسپرماتید گرد، اسپرماتید کشیده، سرتولی و لیدیگ: در گروه سیکلوفسفامید، کاهش معنی¬داری در میانگین تعداد سلول¬های اسپرماتوگونی، اسپرماتوسیت، اسپرماتید گرد، اسپرماتید کشیده، سرتولی و لیدیگ در مقایسه با گروه کنترل، دیده شد (001/0>p). در گروه¬ سیکلوفسفامید + سلنیوم، در میانگین تعداد سلول¬های اسپرماتوگونی (05/0>p)، اسپرماتوسیت، اسپرماتید گرد، اسپرماتید کشیده، سرتولی و لیدیگ (01/0>p) نسبت به گروه سیکلوفسفامید، افزایش معنی¬داری مشاهده شد. این افزایش در میانگین تعداد سلول‌های اسپرماتوگونی، اسپرماتید گرد و اسپرماتید کشیده به حد گروه کنترل رسید (05/0<p). در گروه سلنیوم نسبت به گروه کنترل در هیچ یک از پارامتر‌های یاد شده، تفاوت معنی‌داری دیده نشد (05/0<p) (جدول 4).
بررسی شاخص¬های اسپرماتوژنز و امتیاز جانسن: شاخص ضریب تمایز لوله¬ای، میزان اسپرمیوژنز، ضریب سلولی سرتولی و ضریب میوزی، در گروه سیکلوفسفامید نسبت به گروه کنترل، کاهش معنی¬داری را نشان داد (001/0>p). در گروه سیکلوفسفامید + سلنیوم، افزایش معنی¬داری در تمامی شاخص‌های فوق در مقایسه با گروه سیکلوفسفامید مشاهده شد (001/0>p). این افزایش در شاخص ضریب تمایز لوله¬ای و میزان اسپرمیوژنز به سطح گروه کنترل رسید (05/0<p). میانگین امتیاز جانسن، کاهش معنی¬داری در گروه سیکلوفسفامید نسبت به گروه کنترل نشان داد (001/0>p). در حالی‌که میانگین این پارامتر در گروه سیکلوفسفامید + سلنیوم نسبت به گروه سیکلوفسفامید، افزایش معنی¬داری را نشان داد (001/0>p) که این افزایش در حد گروه کنترل بود (05/0<p). در گروه سلنیوم نسبت به گروه کنترل تفاوت معنی‌داری در هیچ‌یک از شاخص‌ها و امتیاز جانسن مشاهده نشد (05/0<p) (جدول 5).
بررسی میزان MDA  و TAC در بافت بیضه: افزایش معنی‌داری در میانگین غلظت MDA و کاهش معنی‌داری در میانگین TAC بافت بیضه در گروه سیکلوفسفامید در مقایسه با گروه کنترل مشاهده شد (001/0>p). این در حالی‌است که در گروه سیکلوفسفامید + سلنیوم، میانگین غلظت MDA کاهش معنی‌دار (001/0>p) و میانگین غلظت TAC افزایش معنی‌دار (05/0>p) نسبت به گروه سیکلوفسفامید نشان داد. میانگین سطح MDA و TAC بافت در گروه سلنیوم نسبت به گروه کنترل، تفاوت معنی‌داری نداشت (05/0<p) (جدول 6).
وزن موش و وزن بیضه: میانگین وزن اولیه بدن موش¬ها، در بین 4 گروه آزمایش، تفاوت معنی¬داری نداشت. اما میانگین وزن ثانویه بدن موش¬ها و میانگین وزن بیضه، در گروه سیکلوفسفامید نسبت به گروه کنترل کاهش معنی¬داری را نشان داد (001/0>p). میانگین این دو پارامتر در گروه سیکلوفسفامید + سلنیوم، در مقایسه با گروه سیکلوفسفامید، افزایش معنی¬داری را نشان داد (001/0>p) و به سطح گروه کنترل رسید (05/0<p). تفاوت معنی‌داری در میانگین وزن ثانویه بدن موش‌ها و وزن بیضه در گروه سلنیوم در مقایسه با گروه کنترل دیده نشد (05/0<p) (جدول 7).
 
شکل 2: تصاویر میکروسکوپی از بافت بیضه موش¬های بالغ در گروه¬های مختلف. رنگ¬¬‌آمیزی H&E  با بزرگنمایی20×. گروه کنترل (A) آرایش منظم و طبیعی در لوله¬های منی¬ساز و اپتیلیوم زایشی به همراه وجود اسپرماتوزوآ در لومن. گروه سیکلوفسفامید (B) واکوئله شدن اپتیلیوم زایشی (علامت ستاره در شکل)، کاهش ارتفاع اپتلیوم زایشی (پیکان در تصویر) همراه با آرایش نامنظم و غیر طبیعی لوله¬های منی¬ساز و فقدان یا کاهش اسپرماتوزوآ در لومن. گروه سیکلوفسفامید + سلنیوم (C) آرایش بهبود یافته¬ بافت نسبت به گروه سیکلوفسفامید همراه با ساختار منظم و طبیعی¬تر لوله¬های منی¬ساز و اپیتلیوم زایشی در مقایسه با گروه سیکلوفسفامید. گروه سلنیوم (D) نمایی مشابه با گروه کنترل همراه با آرایش منظم لوله¬های منی¬ساز و اپتیلیوم زایشی.

جدول 2: مقایسه میانگین حجم کل بیضه، حجم لوله¬های منی¬¬ساز و حجم بافت بینابینی در گروه¬های مختلف.




جدول 3: مقایسه¬ میانگین طول لوله¬های منی¬ساز (m)، قطر لوله¬های منی¬ساز (µm)، ضخامت غشاء پایه (µm) و ارتفاع اپیتلیوم زایشی(µm) لوله¬های منی¬ساز در گروه¬های مختلف.


جدول 4 مقایسه¬ میانگین تعداد سلول¬های اسپرماتوگونی، اسپرماتوسیت، اسپرماتید گرد، اسپرماتید کشیده، سرتولی و لیدیگ در گروه¬های مختلف.


جدول 5: مقایسه‌ میانگین ضریب تمایز لوله¬ای، شاخص میزان اسپرمیوژنز، ضریب سلول سرتولی، ضریب میوزی و امتیاز جانسن در گروه¬های مختلف.


جدول 6: مقایسه¬ میانگین میزان MDA و TAC در بافت بیضه در گروه¬های مختلف.

جدول 7: مقایسه میانگین وزن بدن و وزن بیضه¬ موش¬ها در گروه¬های مختلف.

 
بحث
نتایج پژوهش حاضر نشان داد که تجویز سیکلوفسفامید موجب کاهش معنی‌دار حجم کل بیضه، حجم لوله‌های منی‌ساز و حجم بافت بینابینی می‌شود. همچنین طول، قطر، ضخامت غشای پایه و ارتفاع اپیتلیوم زایشی لوله‌های منی‌ساز به‌طور قابل‌توجهی کاهش یافت. در کنار این تغییرات ساختاری، تعداد سلول‌های اسپرماتوژنیک، سرتولی و لیدیگ و نیز شاخص‌های اسپرماتوژنز در گروه دریافت‌کننده سیکلوفسفامید نسبت به گروه کنترل به‌طور معنی‌داری کاهش یافت. یافته‌های هیستوپاتولوژیک گزارش‌شده در مطالعات پیشین نیز این نتایج را تأیید می‌کنند. در مطالعه انجام‌شده توسط Moustafa و همکاران (2020)، آتروفی همراه با تغییرات دژنراتیو در لوله‌های منی‌ساز و بافت بینابینی در حیوانات تیمارشده با سیکلوفسفامید مشاهده شد (26). همچنین مطالعه Karimi و همکاران در سال 2020 نشان داد که سیکلوفسفامید باعث کاهش معنادار قطر و ارتفاع اپیتلیوم زایشی لوله‌های منی‌ساز می‌شود (27). این تغییرات به‌طور عمده ناشی از ریزش سلول‌های اپیتلیال و آسیب به سلول‌های سرتولی است که نقش حیاتی در تداوم روند اسپرم‌زایی دارند (28). نتایج گزارش‌شده توسط Delgarm و همکاران در سال 2022 و Kordedeh و همکاران در سال 2019 نیز همسو با یافته‌های حاضر نشان داد که سیکلوفسفامید موجب کاهش قابل‌توجه سلول‌های اسپرماتوگونی، اسپرماتوسیت اولیه، اسپرماتید، سرتولی و لیدیگ می‌شود. این تغییرات همراه با آتروفی شدید لوله‌های منی‌ساز، متلاشی و واکوئله شدن اپیتلیوم ژرمینال، کاهش ارتفاع اپیتلیوم و کاهش تعداد رده‌های سلول‌های زایا بوده و در نهایت منجر به کاهش اسپرم‌زایی در حیوانات تحت درمان شده است (17،29). از نظر مکانیسم‌های مولکولی، سیکلوفسفامید با کاهش بیان پروتئین‌های آنتی‌اکسیدانتی Nrf2 و (HO-1) Heme Oxygenase-1، افزایش بیان (Keap1) kelch-like ECH-associated protein 1 (مهارکننده Nrf2) و نیز افزایش نسبت Bax/Bcl-2 باعث ایجاد اختلال گسترده در ساختار و عملکرد بافت بیضه می‌شود (7). کاهش سطح Nrf2 که تنظیم‌کننده ژن‌های وابسته به عناصر پاسخ آنتی‌اکسیدانتی (Antioxidant Response Element: ARE) است، حساسیت سلول‌های بیضه را نسبت به استرس اکسیداتیو افزایش می‌دهد (30). علاوه بر این، سیکلوفسفامید از طریق ایجاد پیوند متقابل در رشته‌های DNA موجب آسیب ژنومی در سلول‌های در حال تقسیم سریع، از جمله سلول‌های زایا، می‌شود. این آسیب DNA با افزایش بیان پروتئین‌های پروآپوپتوتیک مانند Bax همراه بوده و در نتیجه نرخ مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلولی در اسپرماتوگونی‌ها، اسپرماتوسیت‌ها و اسپرماتیدها افزایش می‌یابد (3،4). در همین راستا، مطالعه Nayak و همکاران در سال 2020 نشان داد که سیکلوفسفامید با کاهش بیان Oct4 (مارکر سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی تمایزنیافته) و Ddx4 (مارکر سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی تمایزش‌یافته)، موجب کاهش جمعیت سلول‌های اسپرماتوژنیک می‌شود (31). همچنین این دارو از طریق مهار فعالیت آنزیم‌های کلیدی استروئیدوژنز شامل سیتوکروم p450scc، آروماتاز و 17 هیدروکسی استروئید دهیدروژناز، سبب کاهش سنتز تستوسترون می‌شود که این امر یکی از عوامل مهم ایجاد اختلال در اسپرماتوژنز به شمار می‌رود (30). نتایج مطالعه حاضر نشان داد که تجویز همزمان سلنیوم با سیکلوفسفامید توانست تا حد زیادی اثرات مخرب سیکلوفسفامید بر پارامترهای مورد بررسی را جبران کند؛ این یافته با نتایج مطالعات پیشین همسو است. Bagheri و همکاران در سال 2020 در بررسی اثر حفاظتی سلنیوم در برابر آسیب‌های ناشی از تشعشعات طی رادیوتراپی یا رادیولوژی نشان دادند که سلنیوم می‌تواند از توقف فرآیند اسپرم‌زایی و آتروفی لوله‌های منی‌ساز جلوگیری کرده و به حفظ سلامت کلی بافت بیضه در موش‌ها کمک کند (32). همچنین گزارش شده است که سلنیوم با کاهش شاخص‌های استرس اکسیداتیو و مهار فعال‌سازی مسیرهای آپوپتوز، موجب افزایش جمعیت سلول‌های زایا، حفظ ساختار طبیعی بافت بیضه و افزایش قطر و ارتفاع اپیتلیوم زایشی لوله‌های منی‌ساز شده و در نتیجه آسیب سلولی ناشی از دوکسوروبیسین را کاهش می‌دهد (33). سلنیوم به‌عنوان یک عنصر معدنی ضروری با خواص آنتی‌اکسیدانتی قوی، نقش مهمی در محافظت از بافت بیضه در برابر استرس اکسیداتیو و حفظ یکپارچگی ساختاری و عملکردی لوله‌های اسپرم‌ساز ایفا می‌کند. این عنصر جزء اصلی سلنوپروتئین‌هایی مانند گلوتاتیون پراکسیداز است که نقش اساسی در خنثی‌سازی ROS دارند. افزایش فعالیت گلوتاتیون پراکسیداز و سایر آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانتی وابسته به سلنیوم می‌تواند به‌طور مؤثری استرس اکسیداتیو را کاهش دهد (34،35). در نتیجه، سلنیوم با کاهش استرس اکسیداتیو از آسیب مستقیم به DNA و غشای سلولی سلول‌های اسپرماتوژنیک و همچنین سلول‌های لیدیگ جلوگیری می‌کند و بدین ترتیب از آتروفی لوله‌های اسپرم‌ساز و اختلال در فرآیند اسپرم‌زایی پیشگیری می‌نماید (33). علاوه بر این، گزارش شده است که سلنیوم می‌تواند بیان ژن‌های کلیدی مرتبط با سنتز تستوسترون از جمله HSD17B1 (Hydroxysteroid 17 Beta Dehydrogenase 1)، CYP17A1 (Cytochrome P450 17A1) و StAR (Steroidogenic Acute Regulatory protein) را افزایش دهد و از این طریق تولید تستوسترون در سلول‌های لیدیگ بیضه را بهبود بخشد؛ فرآیندی که در نهایت اثرات مثبتی بر اسپرماتوژنز دارد (36). در بخش دیگری از نتایج این مطالعه، کاهش معنی‌دار TAC بافت بیضه و در مقابل افزایش معنی‌دار سطح MDA در گروه سیکلوفسفامید نسبت به گروه کنترل مشاهده شد که نشان‌دهنده القای استرس اکسیداتیو در بافت بیضه است. مطالعات نشان داده‌اند که سیکلوفسفامید از طریق افزایش بیان پروتئین Keap1 موجب مهار فاکتور رونویسی Nrf2 شده و در نتیجه بیان ژن‌های آنتی‌اکسیدانتی کلیدی مانند HO-1 و (GPX4) Glutathione Peroxidase 4 کاهش می‌یابد (7، 8). مهار مسیر Nrf2 با کاهش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانتی نظیر سوپراکسید دیسموتاز و گلوتاتیون پراکسیداز و افزایش سطح MDA همراه است که در نهایت منجر به تشدید شرایط استرس اکسیداتیو در بافت بیضه می‌شود (7). در مقابل، در گروه دریافت‌کننده سلنیوم همراه با سیکلوفسفامید کاهش معنی‌داری در سطح MDA و افزایش معنی‌داری در سطح TAC بافت بیضه مشاهده شد. سلنیوم که در ساختار سلنوپروتئین‌ها به شکل سلنوسیستئین حضور دارد و بخشی از ایزوفرم‌های مختلف آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز محسوب می‌شود، به‌عنوان یک مرکز ردوکس عمل کرده و با کمک گلوتاتیون پراکسیدازها از لیپیدهای غشایی در برابر آسیب اکسیداتیو محافظت می‌کند. این عملکرد منجر به کاهش پراکسیداسیون لیپیدی و در نتیجه کاهش تولید MDA می‌شود (11،12). یافته‌های حاصل از پژوهش حاضر نشان داد که تیمار با سیکلوفسفامید موجب کاهش معنی‌دار وزن بدن و وزن بیضه در موش‌ها در مقایسه با گروه کنترل شد. گزارش شده است که سیکلوفسفامید با کاهش سطح چربی‌ها و مهار سنتز پروتئین می‌تواند منجر به کاهش وزن بدن گردد (17). علاوه بر این، سیکلوفسفامید از طریق القای استرس اکسیداتیو در بافت بیضه، افزایش پراکسیداسیون لیپیدی و تحریک آپوپتوز در سلول‌های بیضه، موجب کاهش تعداد سلول‌های اسپرم‌ساز و اختلال در فرآیند اسپرم‌زایی می‌شود؛ پدیده‌ای که به‌عنوان یکی از عوامل مؤثر در کاهش وزن بیضه در اثر تیمار با این دارو مطرح شده است (7). همچنین، این دارو با تأثیر منفی بر محور هیپوتالاموس–هیپوفیز–گناد سبب کاهش قابل‌توجه سطح FSH، LH و تستوسترون می‌شود و این عدم تعادل هورمونی می‌تواند به کاهش وزن بیضه منجر گردد (4،37). از سوی دیگر، تیمار همزمان با سلنیوم در گروه سیکلوفسفامید + سلنیوم موجب افزایش معنی‌دار وزن بدن و وزن بیضه نسبت به گروه دریافت‌کننده سیکلوفسفامید به تنهایی شد. سلنیوم به‌عنوان یک عنصر آنتی‌اکسیدانتی مهم با کاهش استرس اکسیداتیو و افزایش بیان ژن‌های مرتبط با سنتز تستوسترون می‌تواند موجب بهبود فرآیند اسپرماتوژنز و در نتیجه افزایش وزن بیضه شود (36). علاوه بر این، سلنیوم در متابولیسم و تولید هورمون‌های تیروئیدی نقش اساسی دارد که این هورمون‌ها تنظیم‌کننده متابولیسم بدن هستند (13)؛ بنابراین، حضور سلنیوم می‌تواند به حفظ وزن بدن کمک کرده و اثرات نامطلوب سیکلوفسفامید بر کاهش وزن بدن را تا حدی تعدیل کند. به‌دلیل محدودیت‌های مالی، امکان ارزیابی مکانیسم‌های مولکولی مرتبط با استرس اکسیداتیو فراهم نشد که از محدودیت‌های مطالعه حاضر بوده است. بنابراین، پیشنهاد می‌شود در پژوهش‌های آینده بیان ژن‌ها و پروتئین‌های درگیر در مسیرهای آنتی‌اکسیدانتی و استرس اکسیداتیو برای تکمیل بخش مولکولی مطالعه بررسی شود.
نتیجه‌گیری
یافته‌های استریولوژیک و بیوشیمیایی این پژوهش نشان داد که تجویز سیکلوفسفامید در موش‌های نر با ایجاد استرس اکسیداتیو و افزایش پراکسیداسیون لیپیدی موجب بروز آسیب‌های ساختاری قابل‌توجهی در بافت بیضه می‌شود. در مقابل، تجویز همزمان سلنیوم با تقویت سیستم آنتی‌اکسیدانتی وابسته به سلنوپروتئین‌ها و کاهش پراکسیداسیون لیپیدی توانست بخش قابل‌توجهی از این تغییرات نامطلوب را اصلاح کند و ساختار بیضه را تا حد زیادی به شرایط طبیعی نزدیک کند. بنابراین، سلنیوم می‌تواند به‌عنوان یک عامل محافظتی مؤثر در کاهش آسیب‌های بیضه‌ای ناشی از سیکلوفسفامید به‌عنوان یک راهکاری درمانی برای کاهش عوارض تولیدمثلی داروهای شیمی‌درمانی مورد توجه قرار گیرد.
سپاس‌گزاری
این مقاله حاصل از پایان‌نامه کارشناسی‌ارشد می‌باشد. از حمایت‌های مالی معاون پژوهشی و فناوری و همچنین آزمایشگاه تحقیقاتی گروه زیست‌شناسی دانشگاه اراک صمیمانه سپاس‌گزاری می‌گردد.
حامی مالی
معاون پژوهشی و فناوری دانشگاه اراک.
تعارض در منافع
وجود ندارد.
ملاحظات اخلاقی
پروپوزال این مطالعه، توسط کمیته اخلاق دانشگاه اراک مورد تایید قرار گرفته است (کد اخلاق: IR.ARAKU.REC.1402.066)
مشارکت نویسندگان
ملک سلیمانی مهرنجانی: مفهوم‌سازی، مدیریت پروژه، نظارت، تحلیل، نگارش - بررسی و ویرایش. زهرا صفری: روش‌شناسی، گردآوری داده‌ها. سپیده احمدی: روش‌شناسی، گردآوری داده‌ها، تحلیل، نگارش - پیش‌نویس اصلی. همه نویسندگان نسخه نهایی را خوانده و تأیید کرده‌اند.
 

References:
 
    Tripathi DN, Jena GB. Intervention of Astaxanthin Against Cyclophosphamide-Induced Oxidative Stress and DNA Damage: A Study in Mice. Chem Biol Interact 2009; 180(3): 398-406.
    Ghobadi E, Moloudizargari M, Asghari MH, Abdollahi M. The Mechanisms of Cyclophosphamide-Induced Testicular Toxicity and the Protective Agents. Expert Opin Drug Metab Toxicol 2017; 13(5): 525-36.
    Liu X, Li Q, Wang Z, Liu F. Identification of Abnormal Protein Expressions Associated with Mouse Spermatogenesis Induced by Cyclophosphamide. J Cell Mol Med 2021; 25(3): 1624-32.
    Olowe TG, Oyovwi MO, Nwangwa KE, Ohwin EP, Oghenetega OB. Cytotoxic Properties of Cyclophosphamide: A Focus on Its Mechanistic Impacts on Male Gonadal Functions. J Explor Res Pharmacol 2024; 9(2): 106-15.
    Al-Salih HA, Al-Sharafi NM, Al-Qabi SS, Al-Darwesh AA. The Pathological Features of Cyclophosphamide Induced Multi-Organs Toxicity in Male Wister Rats. Syst Rev Pharm 2020; 11(6): 45-9.
    Oyagbemi AA, Omobowale TO, Saba AB, Adedara IA, Olowu ER, Akinrinde AS, et al. Gallic Acid Protects Against Cyclophosphamide‐Induced Toxicity in Testis and Epididymis of Rats. Andrologia 2016; 48(4): 393-401.
    Zhang H, Li N, Zhang Y, Xu Y, Lu F, Lin D, et al. Ganoderma Lucidum Polysaccharide Peptide Alleviates Cyclophosphamide-Induced Male Reproductive Injury by Reducing Oxidative Stress and Apoptosis. Biomedicines 2024; 12(8): 1632.
    Qin Y, Zhao G, Wang Z, Liu M, Deng H, Guo L, et al. Polygonatum Sibiricum Polysaccharide Attenuates Cyclophosphamide-Induced Testicular Damages and Sperm Defects in Male Mice Via Nrf2 Mediating Antioxidant Protective Mechanisms. Int J Biol Macromol 2025; 307(Pt3): 141968.
    Selvakumar E, Prahalathan C, Mythili Y, Varalakshmi P. Beneficial Effects Of DL-Α-Lipoic Acid On Cyclophosphamide-Induced Oxidative Stress In Mitochondrial Fractions Of Rat Testis. Chem Biol Interact 2005; 152(1): 59-66.
    Dinkova-Kostova AT, Abramov AY. The Emerging Role of Nrf2 in Mitochondrial Function. Free Radic Biol Med 2015; 88(Pt B): 179-88.
    Ibrahim HA, Shalaby SI, Hassan AA, Hebishy RM, Ghani EM. Effects of Bleomycin, Selenium, and Vitamin E on Male Fertility: A Review. J Adv Vet Res 2022; 12(6): 815-9.
    Kaur S, Kaur A, Jaswal N, Aniqa A, Sadwal SH, Bharati S. Selenium Attenuates Venlafaxine Hydrochloride-Induced Testicular Damage in Mice Via Modulating Oxidative Stress and Apoptosis. Andrologia 2021; 53(6): e14050.
    Mohammadpour AA, Mohammadeini A. Protective Effect of Selenium in Prednisolone Testicular Toxicity. Comp Clin Pathol 2021; 30(5): 847-56.
    Apaydin FG, Kalender S, Bas H, Demir F, Kalender Y. Lead Nitrate Induced Testicular Toxicity in Diabetic and Non-Diabetic Rats: Protective Role of Sodium Selenite. Braz Arch Biol Technol 2014; 58: 68-74.
    Ibrahim MA, Wani FA, Khalifa AM, Kelleni MT, Anwar MM, Thirunavukkarasu A, et al. Protective Effects of Selenium on Malathion-Induced Testicular Toxicity in Mice. Indian J Anim Res 2020; 54(3): 335-41.
    Mahmoodi M, Bakhshi S, Sadeghzadeh F. Neutralizing the Adverse Effects of Cyclophosphamide on فhe Mouse Testis and Sperm Parameters Through Pentoxifylline: A Molecular and Stereological Study. Andrologia 2022; 54(10): e14543.
    Kordedeh ZS, Ghorbani S, Ahmadi S, Mehranjani MS. Silymarin Mitigates Toxic Effects of Cyclophosphamide on Testicular Tissue and Sperm Parameters in Mice. Reprod Biol 2024; 24(4): 100946.
    Salimnejad R, Rad JS, Nejad DM. Protective Effect of Ghrelin on Oxidative Stress and Tissue Damages of Mice Testes Followed by Chemotherapy with Cyclophosphamide. Crescent J Med Biol Sci 2018; 5(2): 138-43.
    Gunes S, Sahinturk V, Karasati P, Sahin IK, Ayhanci A. Cardioprotective Effect of Selenium Against Cyclophosphamide-Induced Cardiotoxicity in Rats. Biol Trace Elem Res 2016; 1(177): 107-14.
    Gunes S, Sahinturk V, Uslu S, Ayhanci A, Kacar S, Uyar R. Protective Effects of Selenium on Cyclophosphamide-Induced Oxidative Stress and Kidney Injury. Biol Trace Elem Res 2018; 185: 116-23.
    Sadeghzadeh F, Mehranjani MS, Mahmoodi M. Vitamin C Ameliorates the Adverse Effects of Dexamethasone on Sperm Motility, Testosterone Level, And Spermatogenesis Indexes in Mice. Hum Exp Toxicol 2019; 38(4): 409-18.
    Moghanlo H, Shariatzadeh SMA. Beneficial Effects of Spirulina Platensis on Mice Testis Damaged by Silver Nanoparticles. Andrologia 2022; 54: e14606.
    Soleimani Mehranjani M, Azizi M, Sadeghzadeh F. The Effect of Melatonin on Testis Histological Changes and Spermatogenesis Indexes in Mice Following Treatment with Dexamethasone. Drug Chem Toxicol 2022; 45(3): 1140-9.
    Ahmadi S, Soleimani Mehranjani M. Taurine Improves Follicular Survival and Function of Mice Ovarian Grafts Through Increasing CD31 and GDF9 Expression and Reducing Oxidative Stress and Apoptosis. Eur J Pharmacol 2021; 903: 174134.
    Roostaee Z, Soleimani Mehranjani M, Cheraghi E. Fluoxetine Mitigates Human Sperm Quality by Disrupting the Antioxidant Defense System and Altering the Expression of Apoptosis‑Related Genes: An in Vitro Study. Reprod Sci 2025; 32(2): 326-42.
    Moustafa N, Abdul-Hamid M, El-Nesr KA, Abukhadra AM. Protective Effect of Alpha Lipoic Acid and Royal Jelly Against the Side Effects of Cyclophosphamide in Testis of Male Albino Rats. Egypt J Histol 2020; 43(2): 539-53.
    Karimi A, Behmard V, Toghiani S, Moravej FS. The Study of The Protective Effect of Vitamin E and Retinoic Acid on Testicular Tissue in Mice Treated with Cyclophosphamide. Arch Med Lab Sci 2020; 6: 1-8.
    Hosseini A, Zare S, Borzouei Z, Pakdel FG. Cyclophosphamide-Induced Testicular Toxicity Ameliorates by American Ginseng Treatment: An Experimental Study. IJRM 2018; 16(11): 711-18.
    Delgarm N, Morovati-Sharifabad M, Salehi E, Afkhami-Ardakani M, Heydarnejad MS. Exploring the Main Effects of Phoenix Dactylifera on Destructive Changes Caused by Cyclophosphamide in Male Reproductive System in Mice. Vet Res Forum 2022; 13(2): 249-55.
    Raee P, Aghamir S, Ghaffari Novin M, Afshar A, Aghajanpour F, Abdi F, et al. Therapeutic Effects of Curcumin Nanoemulsion on Cyclophosphamide-Induced Testicular Toxicity in Adult Male Mice. Clin Exp Reprod Med 2025; 52(2): 157-66.
    Nayak G, Rao A, Mullick P, Mutalik S, Kalthur SG, Adiga SK, et al. Ethanolic Extract of Moringa Oleifera Leaves Alleviate Cyclophosphamideinduced Testicular Toxicity by Improving Endocrine Function and Modulating Cell Specific Gene Expression in Mouse Testis. J Ethnopharmacol 2020; 259: 112922.
    Bagheri H, Salajegheh A, Javadi A, Amini P, Shekarchi B, Shabeeb D, et al. Radioprotective Effects of Zinc and Selenium on Mice Spermatogenesis. J Biomed Phys Eng 2020; 10(6): 707-12.
    Kaur S, Maan KS, Sadwal S, Aniqa A. Studies on the Ameliorative Potential of Dietary Supplemented Selenium on Doxorubicin-Induced Testicular Damage in Mice. Andrologia 2020; 52(11): e13855.
    Khalid A, Khudhair N, He H, Peng Z, Yaguang T, Guixue Z. Effects of Dietary Selenium Supplementation on Seminiferous Tubules and Selw, Gpx4, LHCGR, And ACE Expression in Chicken Testis. Biol Trace Elem Res 2016; 173: 202-9.
    Yildirim S, Sengul E, Aksu EH, Cinar I, Gelen V, Tekin S. Selenium Reduces Acrylamide-Induced Testicular Toxicity in Rats by Regulating HSD17B1, Star, And CYP17A1 Expression, Oxidative Stress, Inflammation, Apoptosis, Autophagy, And DNA Damage. Environ Toxicol 2024; 39(3): 1402-14.
    Rezaei S, Hosseinimehr SJ, Zargari M, Karimpour Malekshah A, Mirzaei M, Talebpour Amiri F. Protective Effects of Sinapic Acid Against Cyclophosphamide‐Induced Testicular Toxicity Via Inhibiting Oxidative Stress, Caspase‐3 and NF‐Kb Activity in BALB/C Mice. Andrologia 2021; 53(10): e14196.