ماهنامه علمی پ‍ژوهشی

مقدمه
یکی از راه‌های بهبود بقای بیماران سرطانی، درمان با استفاده از نانو‌حامل‌ها برای داروهای ضد سرطان است (1). سیستم‌های نانوکپسوله‌شده مختلف شامل مسیرهای علمی جدیدی هستند که فناوری‌های پیشرفته برای پیشرفت در روش‌های تشخیص و تشخیص انواع مختلف سرطان و هم‌چنین برای تحویل دارو در درمان سرطان به‌خصوص، سیستم‌های نانوکپسوله شده دارند و نقش مهمی در عرضه داروهای ضد سرطان در صنعت داروسازی دارند (2). نانوحامل‌ها دارای یک بار دارویی نسبتاً بالایی هستند و مکانیسم‌های خروج دارو از سلول‌های سرطانی را تحت تأثیر قرار می‌دهند و در نتیجه باعث افزایش اثر ضد سرطانی دارو می شوند. علاوه بر این، نانوذرات حاوی دارو ممکن است بیشتر در محل تومور تجمع کنند (3). بیشتر داروهایی که در درمان سرطان سینه استفاده می‌شوند، دارای مواد نگهدارنده هستندو در بدن زمان آب‌گریزی آنها منجر به فراهمی زیستی کم، حذف و جذب کمتر درکبد می‌شود و به دلیل اینکه حلالیت آب ضعیف و سریع است، متابولیسم داروهای مختلفی که برای درمان این نوع سرطان استفاده می‌شود، دارای اشکالات قابل‌توجهی است. بنابراین، برای کاهش عوارض دارویی و افزایش اثربخشی آن‌ها، سیستم‌های دارورسانی مانند نیوزوم‌ها توسعه یافته‌اند (4) نیوزوم‌ها، منجر به افزایش زمان ماندن دارو، حلالیت داروی آب‌گریز در محلول آبی، فراهمی زیستی، افزایش نفوذ دارو و هدف قرار دادن سلول‌ها و بافت‌های خاص می‌شود. کپسوله کردن داروی مورد نظر در نانوذرات نیز به محافظت از دارو کمک می‌کند (5,6). از جمله گیاهانی که دارای خاصیت ضد سرطانی می‌باشند می توان به درمنه خزری اشاره کرد که به عنوان یک داروی ضد سرطان در نظر گرفته می‌شود (7). اخیراً کاربرد احتمالی درمنه گندواش در درمان COVID-19 به‌طور علمی مورد بحث قرار گرفته است آرتمیزینین‌ها فعالیت‌های کلیدی متعددی را در زمینه سرطان از جمله تحریک پاسخ استرس اکسیداتیو و مرگ سلولی، کاهش تکثیر و ممانعت از رگ‌زایی و متاستاز از خود نشان داده‌اند. این خواص نشان می‌دهد که آرتمیزینین می‌تواند پتانسیل قابل‌توجهی به‌عنوان یک عامل ضد سرطان داشته باشد (3). علی دباغیان امیری و همکاران در سال 2021 عصاره گیاه درمنه بابونه‌ای را در ساختار نیوزوم انکپسوله کرده و اثرات ضدسرطانی و بیان ژن‌های اپوپتوزی Baxو Bcl2 علیه رده سلولی سرطان پستان (MCF-7) مورد بررسی قرار دادند. نتایج نشان داد نانوحامل نیوزوم حاوی عصاره، دارای اثرات ضدسرطانی معناداری نسبت به عصاره آزاد می‌باشد (8). استفاده از عصاره گیاهی مقرون به صرفه بوده و به دلیل عدم وجود سمیت زیست محیطی جهت سنتر نیوزوم و دارا بودن اثرات ضد سرطانی و آپوپتوزی گزینه‌ای مناسب برای درمان سرطان سینه است. هدف از این مطالعه سنتز بیولوژیک نانوذره نیوزوم بااستفاده از عصاره گیاهی درمنه خزری و بررسی اثرات ضد سرطانی و هم‌چنین بررسی بیان ژن‌های آپوپتوزی Caspase3و Caspase9 می باشد.
روش بررسی
عصاره‌گیری و سنتز نانوذره نیوزوم: جهت تهیه عصاره گیاهی (روش ماسراسیون) ابتدا گیاه درمنه خزریاز بانک گیاهی مرکز ذخایر زیستی ایران با کد IBRC P1000008 تهیه گردید. سپس مقدار 50 گرم پودر گیاه آسیاب شده به بشر حاوی 200 سی سی حلال (‌الکل/ آب و الکل/ آب/ هگزان‌) اضافه شده و سپس با استفاده از نایلن درب بشر را پوشانده و آب‌بندی می‌شود. حرارت در دمای 45 درجه سانتیگراد به وسیله استیرر تنظیم شد. با استفاده از پمپ خلا و قیف بوخنر، محلول نهایی صاف شده و به بالن 250 سی‌سی انتقال داده شد. سپس به منظور تغلیظ محلول نهایی، از سیستم تقطیر استفاده کرده و حلال تبخیر شده جداگانه نگهداری شد. در نهایت آنچه در بالن باقی می ماند عصاره می‌باشد (9) برای تهیه نمونه‌ها، ابتدا مقادیر مشخص از کلسترول، اسپین60 و توئین60 در مخلوط حلال های کلروفرم و متانول (نسبت2 به ‌1) حل شد. سپس محلول حاصل، کاملاً هم زده شد تا اجزا به‌طور کامل حل شوند. سپس در بالن مخصوص روتاری ریخته شد و تحت شرایط موررد نظر (دمای 60 درجه سانتی‌گراد و دورrpm  150) در خلاء قرار گرفت تا حلال کاملاً ذوب شود. در مرحله هیدراتاسیون، به فیلم لیپیدی تهیه شده، مقدار 10 سی‌سی بافر فسفات حاوی 10 میلی‌گرم عصاره درمنه (1 mg/ml) در دمای بالای انتقال فاز (60 درجه سانتی گراد) اضافه شد و بااستفاده از روتاری با سرعت rpm 120به مدت نیم ساعت برای هیدراته شدن مناسب چرخید. پس از اتمام مراحل هیدراتاسیون، به منظور کاهش اندازه ذره‌ای، عمل سونیکاسیون به مدت7 دقیقه انجام شد (10).
بررسی خصوصیات فیزیکی و شیمیایی نانونیوزوم ها
تعیین اندازه و توزیع ذرات: جهت اندازه‌گیری قطر دینامیکی نانوذرات از دستگاه زتاسایزر استفاده شده است. جهت بررسی سایز ذرات در دمای 25 درجه سانتی‌گراد از این دستگاه مجهز به لیزر سبز با طول موج 633 نانومتر به روش تفرق دینامیک نوراستفاده گردید (11). پراکندگی نور دینامیک، روشی فیزیکی است که برای تعیین اندازه ذرات موجود در محلول‌ها استفاده می‌شود. این روش غیرمخرب و سریع برای تعیین اندازه ذرات در محدوده چند نانومتر تا میکرون به کار می‌رود. این روش به برهمکنش نور با ذره بستگی دارد. نور پراکنده شده به‌وسیله نانوذرات موجود در سوسپانسیون یا محلول با زمان تغییر می‌کند که می‌تواند به قطر ذره ارتباط داده شود. اندازه ذره‌ای در واقع میانگین قطر ذرات است که به صورتZ-Average  و بر حسب نانومتر نشان داده می‌شود. بنابراین هرچه Z-Average  بیشتر باشد اندازه ذره‌ای بزرگتر خواهد بود (12).
شاخص پراکندگی ذره‌ای (PDI): در واقع درجه غیریکسان بودن توزیع اندازه ذره‌ای می‌باشد. این شاخص توسط دستگاه نانو سایزر محاسبه شد.
تعیین پتانسیل زتا نانونیوزوم ها: پتانسیل زتای یک ذره، بار کلی است که یک ذره در یک محیط ویژه کسب می‌کند و این خاصیت از ویژگی‌های فیزیکی ذرات است و پارامتر خوبی را برای نشان دادن میان کشش مغناطیسی بین ذرات به شمار می رود. میزان بار سطحی و پتانسیل زتای نانونیوزوم حاوی عصاره از طریق دستگاه نانوزتاسایزر در دمای 25 درجه سانتی‌گراد اندازه‌گیری شد (11) پتانسیل زتا معیاری برای اندازه‌گیری بار الکتریکی ذرات معلق در یک محلول است و نشان‌دهنده پایداری سیستم‌های کلوئیدی می‌باشد. پتانسیل زتای منفی نشان‌دهنده بار منفی روی سطح ذرات است که می‌تواند به ایجاد نیروی دافعه بین ذرات کمک کند و از تجمع آن‌ها جلوگیری کند. پتانسیل زتا منفی می‌تواند بیانگر این باشد که ذرات نانو به‌خوبی پخش شده و پایدار هستند. این ویژگی در کاربردهای پزشکی، به‌ویژه در تحویل دارو، بسیار حیاتی است، زیرا پایداری نانوذرات می‌تواند تأثیر مستقیمی بر روی اثربخشی درمانی آن‌ها داشته باشد. به منظور بررسی ساختار ظاهری و موروفولوژی نیوزوم‌های حاوی عصاره گیاه درمنه از روش میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM) استفاده شد (3). روش SEM نسبت به سایر روش‌های میکروسکوپی از دامنه بزرگنمایی بیشتر و تفکیک‌پذیری بهتری نسبت به میکروسکوپ‌های نوری برخوردار است. دامنه بزرگنمایی SEM‌های ابتدایی در حدود 10 تا 100 هزار می‌باشد. رسانا بودن نمونه‌ها جهت تصویربرداری از نمونه‌ها در میکروسکوپ SEM یک امتیاز محسوب می‌شود. جهت تصویربرداری، سوسپانسیون نانوذره تهیه شده در آب دیونیزه به نسبت 1 به 100 رقیق شده، یک قطره از نمونه بر روی یک فیلم هادی نظیر آلومینیوم پخش شده و در دمای اتاق خشک گردید (8). محصورسازی عصاره در نیوزوم و بررسی کارایی محصورسازی (Encapsulation efficiency): کارایی محصورسازی بیانگر نسبت عصاره وارد شده در ساختار نیوزوم نسبت به عصاره اولیه مورد استفاده است. برای جدا کردن عصاره آزاد از نیوزوم حاوی عصاره، از روش سانتریفیوژ استفاده شد به این ترتیب که فرمولاسیون نیوزومی در دمای 4 درجه و با سرعت g 14000 به مدت 45 دقیقه تحت سانتریفیوژ قرار داده شد. نانوذرات حاوی عصاره رسوب کرده و آنچه به عنوان سوپرناتانت می‌ماند داروی آزاد به همراه موادی که وارد واکنش نشده‌اند است. جذب نمونه سوپرناتانت در طول موج nm 540 توسط اسپکتروفتومتر خوانش شد و مقدار عصاره آزاد محاسبه شده از مقدار عصاره اولیه کم و از روی آن میزان درصد کارایی محصورسازی اندازه‌گیری می‌شود (2,3).


بررسی الگوی رهایش عصاره: بررسی رهایش عصاره به‌صورت دینامیک مورد ارزیابی قرار می‌گیرد. بدین صورت که در کیسه دیالیز، مقدار ۲میلی‌لیتر از نانوحامل نیوزومی بارگذاری شده با عصاره و هم‌چنین محلول عصاره تنها (به صورت جداگانه) قرار داده می‌شود. هر یک از کیسه‌ها به‌صورت معلق در مزوز محتوی 50 میلی‌لیتر PBS در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد قرار داده می‌شوند. در ساعت‌های مختلف از مزور نمونه‌گیری انجام می‌شود، بدین صورت که مقدار ۱میلی‌لیتر از PBS  حاوی کیسه دیالیز برداشته و ۱ میلی‌لیتر PBS با دمای ۳۷درجه جایگزین آن می‌شود. عمل نمونه‌گیری تا ۷۲ساعت در فواصل زمانی مشخص ( 48،24،8،4،2،1و 72ساعت ) انجام می‌شود. در پایان، جذب نوری نمونه‌ها توسط دستگاه UV اسپکتروفوتومتر در طول موج بهینه انجام شد و نمودار درصد آزادسازی تجمعی عصاره از نیوزوم در طی مدت زمان ۷۲ ساعت رسم گردید (11). جذب نوری نمونه‌ها به‌صورت جداگانه در طول موج 370 نانومتر با دستگاه اسپکتروفوتومترUV-VIS اندازه‌گیری گردید و سپس با استفاده از منحنی استاندارد، غلظت داروی آزاد شده در طول موج ماکسیمم محاسبه شد. در نهایت نمودار رهایش دارو بر حسب زمان ترسیم گردید.
بررسی اثرات سمیت سلولی نیوزوم حاوی عصاره درمنه خزری: به‌منظور ﺑﺮرﺳﻲ اﺛﺮات ﺳﻤیت سلولی نانوحامل‌های بارگذاری شده ﺑﺎ ﻋﺼﺎره علیه رده سلولی سرطان پستان از روش رنگ‌سنجی M‏TT استفاده گردید. تعداد سلول‌های شمارش شده دو میلیون سلول در حجم یک میلی‌لیتر بود که طبق محاسبات در حجم 10 میکرولیتر، تعداد 20000سلول وجود داشت. پلیت‌های حاوی سلول‌های کشت داده شده به مدت 24 ساعت در انکوباتور کشت سلول انکوبه شدند. بعداز گذشت زمان فوق، محتوای چاهک‌های پلیت 96 خانه‌ای به دقت خارج شد و به آن رنگ ام تی تی(Microculture Tetrazolium Test)اضافه شد و به مدت 4 ساعت تحت شرایط 5CO2 درصد و دمای37 درجه سانتی‌گراد نگه داشته شد و سپس رنگ MTT جداسازی شد و کریستال های فورمازان تولید شده به وسیله سلول‌های زنده در ایزوپروپانول حل گردید. در نهایت جذب نمونه‌ها با استفاده از دستگاه الایزا در طول موج 570 نانومتر خوانش شد و میزان کشندگی سلول‌ها توسط فرمول زیر محاسبه شد: (13)
100×(جذب نوری سلول‌های کنترل/جذب نوری سلول‌های تیمار شده)= میزان بقای سلولی
بررسی میزان بیان ژن‌های آپوپتوزی: در این مطالعه به منظور بررسی میزان بیان ژن های آپوپتوزی caspase3 و caspase9 از روش Real Time PCR استفاده شد. در ابتدا کل RNA سلول‌های تیمارشده و نشده با نانوحامل نیوزومی بارگذاری شده با عصاره با استفاده از کیت استخراج RNA) کیاژن، آمریکا) طبق دستورالعمل آن استخراج شد. ساخت مولکول‌های DNA مکمل با کیت سنتز cDNA) Fermentas، لیتوانی) انجام گرفت. جهت انجامReal Time PCR، از پرایمر‌های اختصاصی، ژن‌های هدف caspase3 و caspase9 بودند و ژن Gapdh به عنوان کنترل داخلی مورد استفاده قرار گرفت. پرایمر های مورد استفاده در این ژن‌ها در جدول 3 آمده است (14). این تحقیق تنها به بررسی بیان ژن‌های Caspase3 و Caspase9 پرداخته است و مکانیسم‌‌های مولکولی دیگر که ممکن است در اثرات ضدسرطانی نانو‌ذره نیوزوم نقش داشته باشند، مورد بررسی قرار نگرفته‌اند. در مطالعات بعدی، باید به بررسی مکانیسم‌های مولکولی دیگر و مسیرهای سیگنالینگ مرتبط با اثرات ضدسرطانی نانوذره نیوزوم پرداخته شود.
تجزیه و تحلیل آماری
در این مطالعه تمامی تست‌ها به‌صورت 3 بار تکرار بود و آنالیز آماری توسط نرم‌افزار GraphPad Prism  ورژن 7 انجام شد. و داده‌های سمیت سلولی و بیان ژن با آنالیز واریانس یک طرفه (one-way analysis of variance ) مورد بررسی قرار گرفت و اطلاعات به‌صورت انحراف معیار ± میانگین نمایش داده شده‌اند و سطح معنی‌داری در آزمون‌ها 05/0 در نظر گرفته شد.
نتایج
سنتز و فرمولاسیون نیوزوم حاوی عصاره درمنه خزری: در این مطالعه، به‌منظور رسیدن به فرمولاسیون بهینه، فرمولاسیون‌های مختلفی بر اساس نسبت مولی اسپان 60/تویین 60، کلسترول و با زمان سونیکاسیون 7 دقیقه تهیه شد (جدول 1). نتایج نشان داد که فرمولاسیون F2 از نظر اندازه و کارایی محصورسازی فرمولاسیون بهینه بود که ادامه تست‌های این مطالعه با این فرمولاسیون انجام گرفت. نکته مهم این است که در این مطالعه، تنها یک دوز مشخص از نانوذره نیوزوم مورد بررسی قرار گرفته است. عدم ارزیابی دوزهای مختلف می‌تواند به عدم شناخت کامل از اثرات ضدسرطانی این ترکیب منجر شود پیشنهاد می‌شود که در مطالعات آینده، اثرات دوزهای مختلف نانوذره بر روی بیان ژن‌های Caspase3 و Caspase9 مورد بررسی قرار گیرد.
 

جدول1: فرمولاسیون‌های نیوزومی حاوی عصاره درمنه



جدول 2: نتایج سنتز فرمولاسیون های نیوزومی حاوی عصاره گیاه درمنه با استفاده از روش هیدراتاسیون فیلم نازک




همانطور که اشاره شد اندازه و پراکندگی ذرات توسط دستگاه نانوزتاسایزر DLS مورد ارزیابی قرار گرفت. شکل 1 نشان‌ دهنده منحنی اندازه ذره‌ای نمونه بهینه است. میانگین سایز ذرات نمونه بهینه 104/1 نانومتر گزارش شد.





شکل1: منحنی اندازه ذره‌ای نمونه بهینه
 
پتانسیل زتا نانونیوزوم‌های حاوی درمنه: همانطور که اشاره شد میزان بار سطحی و پتانسیل زتای نانونیوزوم حاوی عصاره از طریق دستگاه نانوزتاسایزر در دمای 25 درجه سانتی‌گراد ارزیابی شد. شارژ سطحی ذرات نمونه22/5 – گزارش شد که نشان‌دهنده این است که نیوزوم حاوی عصاره سنتز شده آنیونی و دارای بارمنفی است. پتانسیل زتا منفی می‌تواند بیانگر این باشد که ذرات نانو به‌خوبی پخش شده و پایدار هستند. این ویژگی در کاربردهای پزشکی، به‌ویژه در تحویل دارو، بسیار حیاتی است، زیرا پایداری نانوذرات می‌تواند تأثیر مستقیمی بر روی اثربخشی درمانی آن‌ها داشته باشد (7) بار منفی بر روی سطح نانوذرات می‌تواند به افزایش قابلیت اتصال آن‌ها به سلول‌های سرطانی کمک کند. این ویژگی به دلیل وجود بار الکتریکی روی غشای سلول‌ها و تعاملات الکتروستاتیک رخ می‌دهد. بنابراین، داروهای گیاهی می‌توانند به‌صورت هدفمندتری به بافت‌های سرطانی منتقل شوند (15) نانوذرات با پتانسیل زتای منفی قادر به بهبود مرحله جذب دارو از طریق غشاهای سلولی هستند. این پدیده می‌تواند منجر به افزایش میزان داروی گیاهی فعال در داخل سلول‌های سرطانی و به تبع آن، تقویت اثرات درمانی آن شود و اسیبی به بافت‌های سالم و سلول های نرمال اطراف آن وارد نشود. نانوذرات با پتانسیل زتای منفی می‌توانند به‌طور خاص به بافت‌های سرطانی متمایل شوند. این به دلیل وجود بار الکتریکی منفی در غشای سلول‌های سرطانی است که باعث می‌شود این نانوذرات به راحتی به سلول‌های هدف نزدیک شده و داخل ان بروند. نانوذرات با بار منفی می‌توانند به جلوگیری از تخریب دارو در جریان خون کمک کنند، که این ویژگی موجب حفظ کارایی دارو تا زمان رسیدن به بافت هدف می‌شود (16,17).
میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM): همانطور که در تصویر میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM) (شکل 2) مشاهده می‌شود، نیوزوم‌های حاوی عصاره درمنه خزری با غلظت‌های مختلف کاملاً کروی با سطح صاف و یکنواخت هستند.
بررسی الگوی رهایش عصاره درمنه: همانطور که در روش کار ذکر شد میزان رهایش عصاره از فرم نیوزومه توسط روش کیسه دیالیز انجام گردید که در نمودار1 روند آزادشدن تجمعی عصاره تنها و نیوزوم حاوی عصاره درمنه در محیط آزادسازی PBS-SDS در مدت زمان 72 ساعت نشان داده شده است. نمودار 1 نشان‌دهنده روند آزادسازی تجمعی فرم محلول عصاره و نانوحامل حاوی عصاره در محیط آزادسازی PBS در طی 72 ساعت می‌باشد. برای شبیه‌سازی و نزدیک کردن محیط آزادسازی برون‌تنی به شرایط واقعی و درون‌تنی از محیط آزادسازی PBS برای فاز گیرنده استفاده شد که همانطور که در شکل 3 مشهود است، آزادسازی از فرم نانوحامل (81 %) و نیوزوم حاوی عصاره (92 %) طی مدت زمان 72 ساعت آزادسازی بود. در آزادسازی عصاره درمنه میزان 58% عصاره در مدت زمان 8 ساعت اول آزاد شد ولی در همین مدت، میزان رهایش عصاره ازنیوزوم حاوی عصاره مقدار 28% بود. در مدت زمان 24 ساعت، میزان 74% عصاره آزاد در محیط آزاد شده بود ولی در نیوزوم حاوی عصاره، میزان رهایش عصاره، 45% بود. هم‌چنین در مدت زمان‌های 48 و 72 ساعت به ترتیب میزان رهایش عصاره 67% و 81% از نیوزوم حاوی عصاره درمنه بود.
رسم منحنی استاندارد و بررسی جذب و غلظت نمونه: توسط اسپکتروفتومتر می‌توان آنالیزها را به صورت کمی انجام داد. برای این منظور نمودار کالیبراسیون رسم می‌شود و بر اساس این نمودار غلظت محاسبه می‌گردد. چند نمونه با غلظت 20،40،60،80،100،120 تهیه کرده، سپس میزان جذب این نمونه را به وسیله اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری می‌کنیم. در مرحله بعدی نمودار کالیبراسیون را برای این نمونه رسم می‌کنیم. برای به دست آوردن غلظت مجهول ابتدا میزان جذب آن را اندازه‌گیری می‌کنیم. در نهایت از روی نمودار استاندارد و با در دست داشتن میزان جذب، غلظت مجهول را به‌دست می‌آوریم. میزان غلظت مجهول را می‌توانیم از طریق معادله خط نیز محاسبه کنیم. به این صورت که عدد رابه‌جای y قرار می‌دهیم و مقدار x یا غلظت مجهول را به‌دست می‌آوریم:  y=0.0086X 0.2729





شکل2: میانگین پتانسیل زتای ذرات بر حسب میلی ولت .داده هانشان می‌دهد پتانسیل زتای نانوذرات برابرباmv5/22-است.




شکل 3. میکروگراف میکروسکوپ الکترونی SEM از نیوزوم‌های سنتز شده حاوی عصاره درمنه. همانطور که مشاهده می‌شود نانوذرات کروی می‌باشند.






نمودار 1: الگوی رهایش عصاره از نانو حامل نیوزومی بارگزاری شده با عصاره درمنه و عصاره تنها





نمودار2: منحنی استاندارد جهت بررسی جذب و غلظت نمونه
 
بررسی اثرات سمیت سلولی: جهت بررسی اثرات سمیت سلولی نانوحامل نیوزوم حاوی عصاره و عصاره تنها علیه رده سلولی  MCF-7از روش MTT استفاده می‌شود. تیمار سلول‌های MCF_7 با غلظت‌های مختلف 3/13، 6/25،12/5، 50،25 میکروگرم بر میلی‌لیتر نانوحامل نیوزومی حاوی عصاره درمنه با استفاده از تست MTT در مدت زمان 24 ساعت به ترتیب سبب کاهش بقای سول‌ها تا 7/35±74/83، 2/92±67/83، 1/80±67/99، 3/30±57/23، 5/09±39/37 درصد می‌شود به عبارتی هرچه میزان غلظت نیوزوم حاوی عصاره بیشتر می‌شود، میزان بقای سلول‌ها کاهش می یابد و نسبت به گروه کنترل معنادار است (P<0/05). هم‌چنین نتایج سمیت سلولی عصاره تنها نشان می‌دهد که تیمار سلول‌ها با غلظت‌های مختلف 3/13، 6/25،12/5، 50،25 میکروگرم بر میلی‌لیتر سبب کاهش بقای سلول‌ها می‌شود اما از نظر آماری معنادار نیست یعنی نانو حامل نیوزوم فاقد عصاره به تنهایی فاقد سمیت سلولی معناداری است (نمودار‌3). در نهایت تصویربرداری میکروسکوپ نوری از سنجش تست MTT با غلظت‌های مختلف 3/13، 5/25، 12/6، 50،25 میکروگرم بر میلی‌لیتر نیوزوم حاوی عصاره صورت گرفت (شکل 4) .این تحقیق تنها بر روی یک رده سلولی خاص از سرطان پستان (MCF-7) انجام شده است. عدم بررسی اثرات نانو ذره نیوزوم بر روی رده‌های سلولی دیگر می‌تواند به محدودیت در تعمیم نتایج منجر شود.
 میزان بیان ژن‌های آپوپتوزی: بررسی بیان ژن‌های اپوپتوزی‌caspase3  و caspase9 در رده سلولی تیمار شده با نانو حامل نیوزومی بارگذاری شده با عصاره و عصاره تنها با استفاده از روشReal Time PCR  مطالعه شد.نتایج نشان داد که در رده سلولی سرطانی MCF_7 تیمار شده با نانو حامل نیوزوم بارگذاری شده حاوی عصاره نسبت بیان ژن‌های caspase3  وcaspase9  به ژن مرجعGapdh  به ترتیب به میزان 0/34 ± 1/184  (p<0/01)و 0/81  ± 1/68 (P<0/05)  افزایش یافت،یعنی نیوزوم حاوی عصاره موجب افزایش بیان ژن های آپوپتوزی  caspase3 و caspase9 به ژن مرجع Gapdh شد و از لحاظ آماری معنادار بوده است و هم‌چنین در سلول‌های MCF_7 تیمار شده با عصاره تنها، نسبت بیان ژن‌های caspase3  و caspase9 به ترتیب به میزان 0/08  0/66 (P>0/05) و0/22  ± 1/26 (P>0/05) افزایش یافته بود و از نظر آماری معنادار نبود )شکل 5) و (شکل 6) و (شکل‌7).
 




نمودار 3: نمودار ستونی بررسی درصد سنجش سمیت سلولی نیوزوم حاوی عصاره درمنه و عصاره تنها. داده‌ها به‌صورت درصد میزان بقای سلولی ±انحراف معیار تعریف شده است 




شکل 4: تصویربرداری میکروسکوپ نوری از سنجش تست MTT با غلظت‌های مختلف ( 3/13، 12/5،6/25، 50،25)میکروگرم بر میلی‌لیتر نیوزوم‌های سنتز شده حاوی عصاره درمنه خزری.







نمودار 4: میزان بیان ژن های اپوپتوزی caspase3و caspase9در مقایسه باژن کنترل gapdh
(* P<0/05 و ** 0/01 >P (اختلاف معناداری با گروه قبل از تیمار (کنترل) : n=3).





شکل 5: آنالیز منحنی ذوب برای ژن‌های caspase3(سبز رنگ،راست) ، gapdh (قرمز رنگ ،چپ)، و caspase9 (سبز رنگ ،پایین(








نمودار5: نمودار تکثیر ژن های caspase3 (سبز رنگ، بالا)‌، gapdh (قرمز رنگ‌، وسط)، و caspase9 (سبزرنگ‌، پایین)
 
بحث
در این مطالعه، به‌منظور افزایش اثرات ضدسرطانی و اپوپتوزی عصاره گیاهی درمنه، از نانوساختار نیوزوم به‌منظور دارورسانی استفاده شد. فرمولاسیون‌های مختلف نیوزوم‌های حاوی عصاره گیاه درمنه گندواش سنتز گردید و خصوصیات فیزیکی و شیمیایی آن مانند مورفولوژی و اندازه به ترتیب توسط میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM) و DLS اندازه‌گیری شد. مزایای استفاده از نیوزوم¬ها به عنوان حامل دارویی نیوزوم‌ها باعث محلو‌ل سازی داروهای نامحلول در آب شده و یک محیط پایدار را فراهم می کنند. نیوزوم¬ها، آزادسازی(رسانش) کنترل شده ای را برای دارو فراهم می‌‌کنند و به این ترتیب مانع از رهایش سریع دارو می‌گردند که عملکرد درمانی مولکول‌‌های دارویی را (از طریق محافظت از دارو از محیط¬های بیولوژیکی)بهبود می‌‌بخشند (18) استفاده از نانوذرات به عنوان سیستم‌های دارورسانی در حال حاضر سنگ بنای حوزه دارورسانی به منظور بهبود بسیاری از داروهایی است که محدودیت فراهمی زیستی دارند. استفاده از نانوذرات زمان گردش پلاسما را طولانی‌تر کرده و محل‌یابی دارو در بافت‌های هدف را افزایش می دهد و در عین حال عوارض جانبی را کاهش می دهد (19) وزیکول ها به دلیل خواص منحصر به فردی که دارند مانند اندازه نانومتریک، حجم بالای سطح و سهولت تعدیل رهاسازی دارو، حامل‌های دارویی منحصربه‌فردی هستند (20) نانوکپسول‌های حاوی یک داروی ضد سرطان، عمدتاً به دلیل تحویل هدفمند و عملکرد دقیق، جایگزین بسیار امیدوارکننده‌ای برای درمان‌های معمولی ارائه می‌کنند و در نتیجه می‌توانند در کاربردهای متمایز به عنوان حس‌گرهای زیستی یا در تصویربرداری پزشکی، که امکان تشخیص سرطان را فراهم می‌کند، مورد استفاده قرار گیرند (2) مزیت استفاده از مشتقات گیاهی برای درمان سرطان قابلیت استفاده به صورت خوراکی عوارض جانبی کمتر را دارد (14) مقاومت به آپوپتوز از ویژگی‌های سرطان است و کاهش حساسیت به آپوپتوز منجر به افزایش آستانه درمانی برای موارد کلاسیکی مانند شیمی‌درمانی و رادیوتراپی می‌شود، بنابراین یکی از اهداف در درمان سرطان افزایش فعالیت آپوپتوزی در سلول‌های سرطانی است لذا با توجه به اینکه یکی از مکانیسم‌های عملکردی داروهای ضدسرطان القای آپوپتوز است، در این مطالعه بیان ژن‌های کاسپاز3 و 9 از جمله ژنهای القاء کننده مسیر آپوپتوز مورد بررسی قرار گرفته است. کاسپازها جزء خانواده سیستئین پروتئاز هستند که نقش محوری در شروع و فاز اجرایی آپوپتوز ایفا می‌نمایند. به دنبال فعال‌شدن، این آنزیم‌ها روی سوبستراهای خاصی عمل و تغییرات بیوشیمیایی و مورفولوژیک در سلول آپوپتوتیک ایجاد می‌نمایند (21) نتایج مطالعه ما نشان داد که فرمولاسیون نیوزوم از نظر اندازه و بازدهی محصورسازی به ترتیب 208/1 نانومتر و 62/35% بود و شکل ظاهری آن کروی بود و نیوزوم حاوی عصاره موجب افزایش اثرات ضدسرطانی و افزایش بیان ژن‌های آپوپتوزی شد در نتیجه استفاده از نانوذرات به عنوان عامل القا کننده آپوپتوز برای درمان سرطان به‌کار گرفته می شود. مطالعات مختلفی در زمینه سنتز و فرمولاسیون های مختلف نیوزومی برای عصاره‌ها و اسانس‌های گیاهی به انجام رسیده است. محمود بارانی و همکاران در سال 2018 عصاره حنا (Lawsone) را در ساختار نیوزوم انکپسوله کردند و فعالیت ضدتوموری آن را در رده سلولی7 MCF سرطان سینه مورد ارزیابی قرار گرفت و خصوصیات فیزیکی و شیمیایی آن مانند مورفولوژی و اندازه به ترتیب توسط میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM) و DLS اندازه‌گیری شد. نیوزوم‌ها دارای اشکال کروی بودند و ذرات اندازه‌ای به قطر حدود 250 نانومتر داشتند میزان بازدهی انکپسولاسیون حدود 70% بود در صورتی‌که میزان بازدهی انکپسولاسیون مطالعه ما 62/35% شده است. مطالعه نشان داد که عصاره حنا انکپسوله شده در نیوزوم اثرات سمیت سلولی را به‌طور قابل‌توجهی افزایش داده است که نشان دهنده اثرات ضدسرطانی معنادار در مقایسه با عصاره آزاد بود. از این مطالعه می توان نتیجه گرفت که نیوزوم‌ها می‌توانند ترکیبات فتوشیمیایی را محصور کنند و هم‌چنین باعث بهبود کارایی نانوحامل به صورت کنترل شده و به شیوه‌ای پایدار در درمان سرطان عمل کنند (14) محمدرضا حاجی‌زاده و همکاران در سال 2018 عصاره سیب‌زمینی (Diosgenin) را در ساختار نیوزوم انکپسوله کرده و خصوصیات فیزیکی و شیمیایی آن مانند مورفولوژی و اندازه به ترتیب توسط میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM) و DLS اندازه‌گیری شد و هم‌چنین سنجش سمیت سلولی (MTT) را مورد ارزیابی قرار دادند. راندمان بارگذاری و نرخ رهاسازی  Diosgenin از نیوزوم با کیسه دیالیز و طیف سنجی مرئی UV مورد ارزیابی قرار گرفت. روش سنجش سمیت سلولی به‌کار رفت و در نهایت جذب با استفاده از صفحه الایزا در طول موج 570 نانومتر خوانده شد. اندازه نیوزوم‌های خالی و بدون عصاره 100 نانومتر بوده واندازه نیوزوم‌های حاوی عصاره سیب‌زمینی‌ 170 نانومتر شده و افزایش داشته است. در نهایت، آزمون MTT ثابت کرد که سمیت سلولی در عصاره فاقد نیوزوم معنی‌دار نیست یعنی 60% سلول‌ها زنده ماندند، در حالی‌که در عصاره دارای نیوزوم 28% سلول‌ها زنده ماندند پس عصاره حاوی نیوزوم دارای اثر ضد سرطانی قابل‌توجهی در رده سلولی سرطانی HepG2 دارند (22).
نتیجه‌گیری
نتایج این مطالعه نشان داد که سنتز نانوذره نیوزوم حاوی عصاره یک روش آسان‌تر، کم‌ خطرتر و کم هزینه‌‌تر بوده بنابراین بر اساس نتایج این مطالعه می توان نتیجه‌گیری نمود که نیوزوم به عنوان سیستم دارورسانی مناسب می تواند جهت افزایش اثرات ضدسرطانی و اپوپتوزی عصاره گیاه درمنه خزری می‌باشد و در آینده می توان با مطالعات بیشتر از سیستم های نیوزوم جهت دارورسانی هدفمند جهت اهداف درمانی استفاده نمود. با توجه به پتانسیل‌های شگرف این سیستم، پیشنهاد می‌شود که در مطالعات آتی از نیوزوم به عنوان ابزاری برای دارورسانی هدفمند در درمان سرطان و دیگر بیماری‌ها بهره‌برداری شود. این رویکرد نه‌تنها می‌تواند به بهبود نتایج درمانی منجر شود بلکه در راستای کاهش عوارض جانبی نیز مؤثر خواهد بود. نیوزوم‌ها با ایجاد یک سیستم دارورسانی هدفمند و کارآمد، قادرند نسبت به روش‌های سنتی، تأثیر بیشتری بر روی سلول‌های سرطانی داشته باشند. این فناوری نه تنها می‌تواند به افزایش غلظت مؤثر دارو در نواحی هدف کمک کند، بلکه با کاهش عوارض جانبی ناشی از درمان، کیفیت زندگی بیماران را بهبود بخشد. پتانسیل این سیستم نقش مهمی در القای آپوپتوز و کاهش بقای سلول‌های سرطانی می‌باشد. با توجه به این نتایج، توصیه می‌شود که تحقیقات بیشتری در زمینه بهینه‌سازی فرایند تولید و ارزیابی بالینی این نانوذرات انجام شود تا از قابلیت‌های آن‌ها در درمان‌های هدفمند و مؤثر بهره‌برداری شود. این رویکرد می‌تواند به‌عنوان یک استراتژی نوین در درمان سرطان و سایر بیماری‌ها مورد توجه قرار گیرد و افق‌های جدیدی را در تحقیقات دارویی ایجاد کند این دستاورد می‌تواند به عنوان یک گام مهم در مسیر طراحی درمان‌های نوین و مبتنی بر فناوری‌های پیشرفته در پزشکی محسوب شود.
سپاس‌گزاری
این پژوهش حاصل پایان‌نامه کارشناسی ارشد بوده و تمامی منافع مالی توسط محققین پژوهش تامین شده است. بدین وسیله از تمامی عزیزانی که در انجام این تحقیق همکاری نموده‌اند، به ویژه دکتر محمدقادریان تشکر و قدردانی به‌عمل می‌آید.
حامی مالی: ندارد.
تعارض در منافع: وجود ندارد.
ملاحظات اخلاقی
این مقاله حاصل پایان نامه دانشجویی مقطع کارشناسی ارشد می‌باشد که توسط دانشگاه آزاد اسلامی تایید شده است (IR.IAU.TNB.REC.1401.012).
مشارکت نویسندگان
دکتر فریبا خسروی نژاد در ارائه ایده، فریبا خسروی نژاد در طراحی مطالعه، زهرا رستگار در جمع‌آوری داده‌ها، زهرا رستگار در تجزیه و تحلیل داده‌ها مشارکت داشته و همه نویسندگان در تدوین، ویرایش اولیه و نهایی مقاله و پاسخگویی به سوالات مرتبط با مقاله سهیم هستند.
 
 

References:
 
1-    Kopeckova K, Eckschlager T, Sirc J, Hobzova R, Plch J, Hrabeta J, et al. Nanodrugs used in cancer therapy. Biomedical Papers of the Medical Faculty of Palacky University in Olomouc. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub 2019; 163(2): 122-31.
2-    Montané X, Bajek A, Roszkowski K, Montornés JM, Giamberini M, Roszkowski S, et al. Encapsulation for Cancer Therapy. Molecules 2020; 25(7): 1605.
3-    Meng J, Guo F, Xu H, Liang W, Wang C, Yang XD. Combination Therapy Using Co-Encapsulated Resveratrol and Paclitaxel in Liposomes for Drug Resistance Reversal in Breast Cancer Cells in Vivo. Scientific Reports 2016; 6(1): 22390.
4-    Akbarzadeh I, Shayan M, Bourbour M, Moghtaderi M, Noorbazargan H, Eshrati Yeganeh F, et al. Preparation, Optimization and In-Vitro Evaluation of Curcumin-Loaded Niosome@ Calcium Alginate Nanocarrier as a New Approach for Breast Cancer Treatment. Biology 2021; 10(3): 173.
5-    Qamar Z, Qizilbash FF, Iqubal MK, Ali A, Narang JK, Ali J, Baboota S. Nano-Based Drug Delivery System: Recent Strategies for the Treatment of Ocular Disease and Future Perspective. Recent Pat Drug Deliv Formul 2019; 13(4): 246-54.
6-    Douglas KL, Tabrizian M. Effect of Experimental Parameters on the Formation of Alginate–Chitosan Nanoparticles and Evaluation of their Potential Application as DNA Carrier. J Biomater Sci Polym Ed 2005; 16(1): 43-56.
7-    Yan L, Xiong C, Xu P, Zhu J, Yang Z, Ren H, et al., Structural Characterization and in Vitro Antitumor Activity of a Polysaccharide from Artemisia Annua L.(Huang Huahao). Carbohydr Polym 2019; 213: 361-9.
8-    Dabaghian Amiri A, Mirzaie A, Ali Asgari E, Mahmoudzadeh A. Preparation of Niosome Loaded Artemisia Chamamelifolia Extract: Antib acterial and Anti-Cancer Activities and Apoptosis Gene Expression Analysis in Breast Cancer Cell Line (MCF-7). Feyz Med Sci J 2021; 25(2): 839-49.[Persian]
9-    Tabatabai Yazdi F, Ali Zadeh Behbahani B, Alghoneh A, Zanganeh H, Optimization of extraction of Mespilus germanica by mixture design and investigation of its effect on Infectious Microorganisms “in vitro”. Journal of Food Science and Technology (Iran) 2016; 13(52): 131-45.
10-    Sahab-Negah S, Ariakia F, Jalili-Nik M, Afshari AR, Salehi S, Samini F, et al., Curcumin Loaded in Niosomal Nanoparticles Improved the Anti-Tumor Effects of Free Curcumin on Glioblastoma Stem-Like Cells: An in Vitro Study. Molecular Neurobiology 2020; 57(8): 3391-411.
11-    Askari M, Nikoonahad Lotfabadi N. Evaluation of Niosomal Nano-Carriers Capabilities on Toxicity Preservation and Delivery of Pomegranate Peel Extract in Cell Culture Conditions (MCF-7 Cell Line of Breast Cancer). Daneshvar Medicine 2018; 26(5(: 20-9. [Persian]
12-    Wichayapreechar P, Anuchapreeda S, Phongpradist R, Rungseevijitprapa W, Ampasavate C., Dermal Targeting of Centella Asiatica Extract Using Hyaluronic Acid Surface Modified Niosomes. J Liposome Res 2020; 30(2): 197-207.
13-    Buttacavoli M, Albanese NN, Di Cara G, Alduina R, Faleri C, Gallo M, et al., Anticancer Activity of Biogenerated Silver Nanoparticles: An Integrated Proteomic Investigation. Oncotarget 2018; 9(11): 9685.
14-    Barani M, Mirzaei M, Torkzadeh-Mahani M, Nematollahi MH.., Lawsone-Loaded Niosome and Its Antitumor Activity in Mcf-7 Breast Cancer Cell Line: A Nano-Herbal Treatment for Cancer. DARU 2018; 26: 11-7.
15-    Peer D, Karp JM, Hong S, Farokhzad OC, Margalit R, Langer R. Nanocarriers as an Emerging Platform for Cancer Therapy. Nano-Enabled Medical Applications 2020: 61-91.
16-    Sahay G, Alakhova DY, Kabanov AV. Endocytosis of Nanomedicines. J Control Release 2010; 145(3): 182-95.
17-    Mohanraj V, Chen Y. Nanoparticles-A Review. Tropical Journal of Pharmaceutical Research 2006; 5(1): 561-73.
18-    Bhardwaj P, Tripathi P, Gupta R, Pandey S. Niosomes: A Review on Niosomal Research in the Last Decade. Journal of Drug Delivery Science and Technology 2020; 56: 101581.
19-    Obeid MA, Gany SAS, Gray AI, Young L, Igoli JO, Ferro VA. Niosome-Encapsulated Balanocarpol: Compound Isolation, Characterisation, and Cytotoxicity Evaluation Against Human Breast and Ovarian Cancer Cell Lines. Nanotechnology 2020; 31(19): 195101.
20-    García-Manrique P, Machado ND, Fernández MA, Blanco-López MC, Matos M, Gutiérrez G. Effect of Drug Molecular Weight on Niosomes Size and Encapsulation Efficiency. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 2020; 186: 110711.
21-    Raimondo S, Giavaresi G, Lorico A, Alessandro R. Extracellular Vesicles As Biological Shuttles for Targeted Therapies. Int J Mol Sci 2019; 20(8): 1848.
22-    Hajizadeh MR, Parvaz N, Barani M, Khoshdel A, Fahmidehkar MA, Mahmoodi M. Diosgenin-Loaded Niosome as an Effective Phytochemical Nanocarrier: Physicochemical Characterization, Loading Efficiency, and Cytotoxicity Assay. Daru 2019; 27: 329-39.