ماهنامه علمی پ‍ژوهشی

مقدمه
استئوآرتریت به‌عنوان یکی از بیماری‌های رایج است که میلیون‌ها انسان را در سال درگیر می‌کند. این بیماری به‌صورت از دست دادن غضروف مفصلی، تغییرات استخوانی هایپرتروفیک و التهاب غشای سینوویال توصیف می‌شود (1). اگرچه علت اصلی ابتلا به استئوآرتریت (OA) هنوز کاملاً درک نشده است، اما یک بیماری مفصلی دژنراتیو مفصل است که با تجزیه ماتریکس خارج سلولی غضروف (ECM) مشخص می‌شود. در شرایط عادی‌، در سلول‌های غضروف مفصلی تعادل پویا بین سنتز و تخریب اجزایECM‌، از جمله فیبرهای کلاژن نوع II و پروتئوگلیکان (PG) وجود دارد (1). درOA ، اختلال در تعادل ماتریس وجود دارد که منجر به از دست رفتن تدریجی بافت غضروف و گسترش کلونال سلول‌ها در مناطق تخلیه شده می‌شود. متابولیسم سلول‌های غضروفی به‌دلیل تولید بیش از حد فاکتورهای کاتابولیک تخریب می‌شود‌، این فاکتورهای کاتابولیک عبارتند از: متالوپروتئینازهای ماتریسی (MMPs)  و سایر سیتوکین‌های پیش ‌التهابی هستند که موجب تخریب پروتئوگلیکان در ماتریکس غضروف می‌شود (2). از طرفی FGF2 عضو خانواده بزرگی از FGFاز پروتئین‌های مرتبط است که رشد‌، تمایز‌، مهاجرت و بقای طیف گسترده‌ای از انواع سلول‌ها را تعدیل می‌کند (3). با این‌حال مطالعات در مورد FGF-2 با توجه به نقش آنابولیک یا کاتابولیک آن در هموستاز غضروف مفصلی نتایج متناقض را به‌همراه داشته است (3). محققان متعددی نقش محافظت کننده FGF-2 را در متابولیسم غضروف پیشنهاد کرده‌اند. به عنوان مثال FGF-2 پس از آسیب دیدگی مکانیکی ECM آزاد می‌شود و اثرات محافظتی و مفیدی را در مفاصل موش ایجاد می‌کند. در موش‌های فاقد FGF-2 با افزایش سن و بی‌ثبات کردن مفصل درگیری استئوآرتریت افزایش می‌یابد (4). در مقابل محققان دیگر نقش کاتابولیکFGF-2  را در هموستاز غضروف مفصلی نشان داده‌اند (3، 5، 6). در غضروف مفصلی انسان FGF-2 با تخریب مفاصل از طریق تنظیم MMPs، آگریکان‌ها agrecanases و هم‌چنین تحریک گونه‌های اکسیژن فعال مانند نیتریک اکسید و آنیون سوپر اکسید همراه است و ممکن است باعث تسریع تخریب غضروف شود (3، 5). در هر دو سلول‌های غضروفی مفصلی و کندروسیت‌های منیسک‌،FGF-2  باعث تغییر نسبت بین کلاژن نوع II و نوع I می‌شود و به طور بالقوه باعث تشکیل فیبروکارتیلاژ، به‌ عنوان جایگزین معیوب برای غضروف هیالین سالم می‌شود (7).  FGF-2هم‌چنین مسیرNFκB  را فعال می‌کند‌، که در جهت فعال کردن فاکتور Elk-1 موازی با مسیرMAP  کیناز است و رونویسی MMP-13 را تحریک می‌کند (2). اخیراً‌، یان و همکاران اظهار داشتند که نقش‌های متضاد FGF-2 ممکن است به تفاوت گیرنده‌های FGF (FGFR)  در بافت‌ها بستگی داشته باشد (6). FGFR3 بعد از اتصال لیگاند توسط FGF-18‌، نقش مهمی در سنتز عضروف مفصلی دارد‌، که با تحریک پروستاگلاندینها همراه است (8). البته اثرات FGF-2 بر غضروف مفصلی ممکن است به گونه‌های مختلف فعال وابسته باشد. به‌ عنوان مثال‌، در غضروف موش‌، FGF-2 اثرات آنابولیکی را القا میکند (4). در حالیکه نقش آن در غضروف مفصلی انسان به نظر می‌رسد کاتابولیک و ضد آنابولیک است (5، 3). نشانگرهای زیستی مربوط به شروع انحطاط غضروف مفصلی در مرحله اولیه شامل تعدادی آنزیم تخریب‌کننده ماتریس، مانند خانواده متالوپروتئیناز ماتریکس‌(MMP) ، خانواده متالوپروتئیناز با ترومبوسپوندین نوع‌1(ADAMTS) ، اگریکان‌ها و غیره می‌باشد (9). بیشترین مطالعه در متالوپروتئینازهای ماتریکس و نقش آن در غضروفدر MMP-13 اتفاق افتاده است‌، زیرا به‌دلیل توانایی قوی آن در برش دادن کلاژن نوعII ، عامل اصلی کاتابولیک در استئوآرتریت محسوب می‌شود. در یک مدل OA  آزمایشی موش با استفاده از تکنیک میکروسکوپی‌، سطح MMP-13  با حضور سلول‌های غضروفی پاتولوژیک که در مرحله اولیه توسعه استئوآرتریت تمایز یافته هایپرتروفیک hypertrophic differentiation ارتباط دارد و بیان بیش از حد آن میتواند از طریق افزایش تخریب ECM  سبب استئوآرتریت اولیه گردد (1). در نمونه‌های بالینی و در مرحله اولیه تنظیم افزایشی 13MMP- غضروف انسانی کاهش می‌یابد. بنابراین‌،MMP-13 یک نقش محوری در شبکه تخریب غضروفی است (10). گالویس و همکاران در سال 2004 اثر ورزش با شدت متوسط را در بهبود استئوآرتریت مثبت ارزیابی کردند. نتایج این تحقیقات نشان داد که دویدن با شدت کم و متوسط تاثیر مثبتی بر کاهش زخم‌های غضروفی دارد ولی تمرین با شدت بالا باعث تخریب سطح مفصلی می‌گردد (11). هم‌چنین سیفوئنتس و همکاران، 2010 نیز دویدن با شدت متوسط را بر زانوی موش صحرایی مبتلا به استئوآرتریت مثبت ارزیابی کردند (12). عزت‌پناه و همکاران در سال 2016 نشان دادند که ورزش‌های سبک و مفرح مثل پیاده‌روی و شنا برای بهبود استئوآرتریت بیشتر توصیه می‌شوند. ورزش کردن، عضلات اطراف مفاصل را تقویت کرده و سبب افزایش ثبات مفصل می‌گردد (13). البته گالویس و همکاران نشان دادند که فشار زیاد، استفاده بیش ازحد و ضربه به مفصل زانو یکی از علل فرسایش مفصل زانو و شروع استئوآرتریت است. اما در بررسی خود در زانوی بازیکنان تنیس به این نتیجه رسیدند که بین ایجاد استئوآرتریت در بازیکنان تنیس و گروه کنترل تفاوتی وجود نداشت (11، 13). رمضانی و همکارن در سال 2011 در زمینه استئوآرتریت زانو در ورزش کشتی نشان دادند که بین میانگین درجه استئوآرتریت زانو در ورزشکاران و غیر ورزشکاران تفاوت زیادی وجود دارد. نتایج این تحقیقات نشان داد که میانگین میزان شدت درد، میزان علایم و مشکلات عملکرد حرکتی در فعالیت‌های روزانه در گروه ورزشکار پایین‌تر از غیر ورزشکار بود (14).
سن تنو و همکاران (2018) به مقایسه تاثیر سلول‌های بنیادی و تمرینات بدنی بر درمان بیماران دارای استئوآرتریت ملایم زانو پرداختند برنامه تمرینی شامل شش هفته تمرین مقاومتی بر اندام تحتانی و هم‌چنین تمرین هوازی پیاده‌روی و قدم‌زدن در آب بود. نتایج نشان داد که با وجود ماثر بودن تمرینات بدنی، نقش تزریق سلول‌های بنیادی بر درمان استئوآرتریت بیشتر بود (15). سازمان جراحان حرفه ای آمریکا و انجمن روماتولوژی، مداخله‌های محافظه‌کارانه را به عنوان راهبرد اصلی برای کنترل استئوآرتریت زانو پیشنهاد کرده‌اند و انجام تمرینات مختلف ورزشی و شیوه زندگی فعال، برای کاهش نشانه‌ها و عوارض استئوآرتریت مفید است و هم‌چنین سبب بهبود تعادل، انعطاف‌پذیری، قدرت و دامنه حرکتی مفصل در عضو صدمه می‌گردد‌. البته سلول‌های بنیادی، توانایی تکثیر و تمایز را دارند. سلول درمانی، روش رساندن مستقیم و موضعی سوسپانسیون سلولی به محل است. تزریق مستقیم سلول به‌ محل آسیب می‌تواند مانع ادامه تخریب بافت شود و در کنار آن ترمیم را تحریک کند. با این حال، نتایج سلول درمانی به میزان آسیب، نوع سلول درمانی، وسیله تزریق، مقدار و روش تزریق وابسته است (16). امروزه نقش سلول بنیادی در پزشکی، افزایش یافته است، زیرا که منجر به تولید سلول‌های مورد نظر و بافت قابل پیوند می‌گردد (17). با توجه به روند رو به رشد چاقی و سالمندی، شیوع استئوآرتریت و هزینه‌های اقتصادی آن نیز رو به افزایش است. از این رو، نیاز به اعمال مداخله‌های ‌مناسب برای سالمندان مبتلا به استئوآرتریت زانو، بیش از پیش نیاز است. با توجه به نیاز جامعه در پیشگیری و درمان استئوآرتریت و نتایج ضد و نقیض در مقالات مختلف محقق به‌دنبال این هدف است که آیا اثر تمرینات استقامتی و سلول‌های بنیادی بر بیان ژن PDGF و PDGFr در بافت زانو موش‌های مبتلا به استئوآرتریت زانو موثر است.
روش بررسی
آزمودنی‌های این طرح پژوهشی شامل موش‌های صحرایی‌نر بالغ 8-12 هفته‌ای ویستار بودند که در این طرح تجربی 35 سر موش با وزن تقریبی 300-250 گرم از مرکز تحقیقات آزمایشگاه حیوانی دانشگاه آزاد اسلامی واحد ساری انتخاب و به 5 گروه 7‌تایی تقسیم شدند. موش‌ها به‌صورت گروه‌های 3‌تایی در هر قفس در شرایط اتاق (قفس‌هایی از جنس پلی کربنات شفاف به ابعاد 15 × 26/5 × 42‌، دمای 2 ± 22 درجه سانتی‌گراد، رطوبت 5 ± 50 درصد و چرخه روشنایی به تاریکی 12:12 با تهویه مناسب نگهداری شدند. در طول زمان تحقیق حیوانات از غذای پلت ساخت شرکت به‌پرورکرج روزانه به میزان 10 گرم به ازای هر 100 گرم وزن بدن (با توجه به وزن کشی هفتگی) تغذیه شدند و به ‌صورت آزاد از بطری‌هایی به آب مصرفی دسترسی داشتند. استئوآرتریت به‌روش جراحی و بر اساس روش یامانی و همکاران (2014) القا شد (18). به‌طور مختصر، ابتدا موش‌ها با داروی کتامین و زایلازین بی‌هوش شدند. بعد از شیو کردن زانوی پای راست توسط تیغ بیسوری یک برش افقی 1 سانتی‌متری در بخش داخلی مفصل زانو ایجاد شد. مفصل زانو بالافاصله از طریق دررفتگی جانبی کشگک و رباط کشگکی باز شد. پس از کنار زدن پوست لیگامان داخلی جانبی زانو کنار زده می‌شود تا مینیسک داخلی مشاهده شود. سپس با ایجاد یک برش به‌صورت ناقص منجر به پارگی و ایجاد آسیب در مینیسک می‌شود و در آخر ناحیه به روش استریل بخیه زده می‌شود. موش‌های مبتلا به‌استئوآرتریت به 4 گروه شم (کنترل – بیمار)، تمرین، سلول‌های بنیادی، تمرین- سلول‌های بنیادی تقسیم شدند. گروه کنترل مفصل زانو طبیعی داشتند و هیچ مورد درمانی دریافت نکردند. به‌منظور استفاده از سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش‌های صحرایی‌نر بالغ‌نژاد ویستار (با وزن تقریبی 300-250 گرم) پس از کشته شدن حیوان از ناحیه استخوان ران و درشت نئی سلول مغز استخوان جمع‌آوری و MSCs جدا شده در محیطی با DMEM با 20%FBS در طول یک شبانه روز برای انتخاب سلول‌های چسبان انکوبه شدند. کشت‌ها از محیط فلاسک هر سه روز تعویض شدند تا سلول‌هایی که نچسبیده بودند جدا شوند و MSCs‌ها بعد از 3 تا 4 بار پاساژ شدن به درجه خلوص رسیدند و به هدف تزریق انتخاب شدند. پس از کشت در آزمایشگاه برای هر موش تعداد یک میلیون به ازای یک کیلوگرم وزن بدن موش آماده‌سازی خواهد شد و در طول دوره ریکاوری و به عنوان یک بار تزریق در محل القاء مدل سلول‌ها تزریق خواهند شد. گروه موش‌های صحرایی MSCs تزریق داخل سلول‌های 106*1 سلول/کیلوگرم را دریافت کردند. MSCs‌ها به مفصل زانو راست تزریق شدند. آشنایی با محیط پژوهش و نوار گردان بود. بدین منظور موش‌ها در این مرحله 5 روز، یک بار در هفته به‌ مدت 10 دقیقه با سرعت 16 متر بر دقیقه و شیب صفر درصد بر روی تردمیل فعالیت کردند. برنامه تمرینی با 30 دقیقه دویدن بر روی تردمیل بدون شیب و با سرعت 16 متر در دقیقه در هفته اول شروع شد که به تدریج به 50 دقیقه در هفته سوم رسید. گرم‌کردن و سرد کردن در مدت زمان 5 دقیقه در ابتدا و انتهای تمرین انجام شد. 8 هفته پس از اجرای تحقیق تمام حیوانات با شرایط کاملاً مشابه و به‌دنبال 12 تا 14 ساعت ناشتایی و 48 ساعت پس از آخرین جلسه تمرینی و تزریقات (جهت حذف اثرات حاد تمرین و مکمل)، یکی از ابزارهای مورد استفاده در این تحقیق تزریق داخل صفاقی کتامین (50-30 میلی‌گرم بازای هر کیلوگرم) و زایلوزین (5-3 میلی‌گرم بازای هر کیلوگرم وزن) بود که به کمک آن موش‌ها بی‌هوش و کشته‌ شدند. از ابزارهای دیگر مورد استفاده نمک بافر فسفات  (0.01 M; pH 7.0)بود که بافت‌های غضروفی در در دمای 4 درجه سانتی‌گراد در آن جدا و همگن شدند (Hielscher ,UP100H). RNA از بافت غضروف با استفاده از کیتRNX-Plus  ساخت شرکت سیناژن، ایران استخراج شد. از ابزارهای دیگر مورد استفاده در این تحقیق: کلروفرم‌, ایزوپروپانول, اتانول 75%,PBS استریل و ویال‌های 1.5 میلی‌لیتری استریل شده با اتوکلاو بود. ابتدا سلول را از فلاسک با تریپسینه کردن جدا و با سانتریفیوژ رسوب می‌دهیم. سپس مقدار 1 میلی لیتر از محلول plusRNA را به نمونه سلولی اضافه می‌گردد. سپس مخلول ایجاد شده را ویال 1.5 میلی‌لیتری منتقل می‌کنیم سپس این مخلوط را به مدت 10 الی 15 دقیقه هموژن و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه می‌کنیم. سپس مقدار 200 لاندا کلروفرم به ویال اضافه می‌کنیم. سپس ویال به مدت 5 الی 10 دقیقه روی یخ انکوبه می‌گردد. ویال در دمای 4 درجه و با دور rpm12000- 13000 به مدت 15-30 دقیقه سانتریفیوژ می‌گردد. در این مرحله سه بخش ایجاد می‌گردد. فاز آبی بالایی شامل RNA است. فاز سفید میانی پروتئین است و فاز پایینی شامل DNA و فنول است. سپس با احتیاط فاز آبی بالایی را برداشته و به یک ویال بدون RNase منتقل می‌گردد.کمیت و کیفیت‌RNA های استخراج شده با استفاده از روش طیف سنجی نانو دروپ ND-1000  در نظر گرفته شد(Thermo Sci ,Newington, NH). DNA  تکمیلی (cDNA) از نمونههای RNA با استفاده از (Thermo science, Germany) RevertAid Reverse Transcriptase  در 42 درجه سانتی‌گراد به مدت یک ساعت و آغازگرهای هگزامر تصادفی  (Thermo science, Germ any) سنتز شد. یک ترموسیکلر Rotor-Gene 6000 و Real Q-PCR 29 Master Mix Kit  در 40 چرخه برای تقویت استفاده شدند. هر واکنش شامل 5 میکرولیتر میکرون مستر و پرایمر‌های 100 نانومتری بود. مرحله نگهداری RT-PCR در 10:00 دقیقه 95 درجه سانتی‌گراد بود. مراحل چرخه به شرح زیر بود: 40 چرخه؛ 95.0  درجه سانتی‌گراد به مدت 15 ثانیه؛  60 درجه سانتی‌گراد به مدت یک دقیقه. توالی‌های اولیه به شرح زیر سنتز شدند:  Delta Ct (ΔCT) با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد:[ΔCT= CT (target) – CT] . سطح بیان ژن با روش 2–ΔCt  تعیین شد.
 
 
تجزیه و تحلیل آماری
جهت تعیین نرمال بودن توزیع دادهها از آزمون شاپیروویلک و بررسی تجانس واریانسها از آزمون لوین استفاده می‌شود. هم‌چنین برای بررسی تغییرات معنی‌داری هر یک از متغیرهای تحقیق، بین گروه‌های مختلف، از روش آنالیز واریانس یک راهه و در صورت مشاهده تفاوت معنی‌دار آماری از آزمون تعقیبی توکی جهت تعیین محل اختلاف بین گروهی استفاده می‌گردد. سطح معنی‌داری برای تمام محاسبات 0/05>P در نظر گرفته می‌شود. کلیه عملیات آماری با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 16 انجام می‌گیرد.
ملاحظات اخلاقی
این پژوهش توسط کمیته مراقبت از حیوانات در دانشگاه آزاد اسلامی واحد‌ساری به شماره R.IAU.SARI.REC.1397.8 تصویب شد.
نتایج
نتایج نشان می‌دهد تفاوت معنی‌داری در میانگین و انحراف معیار سطح بیان FGF2 بین گروه‌های مختلف مشاهده گردید (p<0.000). کمترین بیان FGF2 درگروه مکمل سالم و بیشترین سطوح آن در گروه تمرین و سالین مشاهده شد. هم‌چنین تفاوت معنی‌داری در میانگین و انحراف معیار پروتئین MMP13 بین گروه‌های مختلف مشاهده گردید (p<0.000). نتایج نشان می‌دهد که بیان ژن MMP13 در گروه‌های سالین روند کاهشی و در گروه سالین و تمرین افزایش داشته است. (جدول 1). تجزیه و تحلیل داده‌ها نشان داد که تمرینات بدنی و درمان با سلول‌های بنیادی بر بیان ژنFGF-2  موش‌های مبتلا به استئوآرتریت در گروه‌های مختلف تاثیر دارد. هم‌چنین با استفاده از آزمون تعقیبی توکی سطح تغییرات بیان ژن FGF-2 در بین گروه کنترل با گروه سالین، تمرین، بنیادی و تمرین- بنیادی معنی‌دار بود (جدول2).
تجزیه و تحلیل داده‌ها نشان داد که تمرینات بدنی و درمان با سلول‌های بنیادی بر بیانMMP-13  موش‌های مبتلا به استئوآرتریت در گروه‌های مختلف تاثیر دارد. هم‌چنین با استفاده از آزمون تعقیبی توکی تفاوت سطح تغییرات بیان ژن MMP-13 در بین گروه‌های مختلف نشان داده شده است. این تغییرات بین گروه کنترل با گروه سالین، تمرین و تمرین-بنیادی معنی‌دار بود. هم‌چنین بین گروه سالین با گروه تمرین، بنیادی و تمرین-بنیادی نیز تفاوت معنی‌دار وجود داشت و البته بین گروه تمرین با گروه بنیادی نیز معنی‌دار بود (جدول 3).
 جدول1: ویژگی‌های توصیفی متغیرهای تحقیق دربافتزانو موش‌های مبتلا به استئوآرتریت (میانگین±انحراف معیار)


جدول 2: نتایج آزمون تحلیل واریانس مربوط به بیان ژن FGF2 در گروه‌های مختلف

    

نمودار 1: مقایسه تغییرات بین مقادیر بیان ژن FGF2  در گروه‌های تحقیق
تفاوت معنادار با گروه سالم
جدول 3: نتایج آزمون تحلیل واریانس مربوط به بیان ژن MMP13 در گروه‌های مختلف

       

نمودار2: مقایسه تغییرات بین مقادیر بیان ژن MMP13  در گروه‌های تحقیق
 تفاوت معنادار با گروه سالم        تفاوت معنادار با گروه سالین
 
بحث
در این تحقیق تاثیر تمرینات استقامتی و مصرف سلول‌های بنیادی بر بیان ژن FGF2 و MMP13 در بافتزانو موش‌های مبتلا به استئوآرتریت زانو مورد بررسی قرار گرفته است. تجزیه و تحلیل داده‌ها نشان داد که تمرینات بدنی و سلول‌های بنیادی بر بیان ژن  FGF2و MMP13 موش‌های مبتلا به ‌استئوآرتریت در گروه‌های مختلف تفاوت معناداری داشت. هم‌چنین آزمون تعقیبی نشان داد که سطح تغییرات بیان ژن FGF2 در گروه شم نسبت به گروه سالم افزایش معناداری داشت؛ در حالی‌که تمرینات بدنی و سلول‌های بنیادی موجب کاهش سطح FGF2 در گروه‌های تجربی شد؛ اما به سطح معناداری نرسید. خانواده فاکتور رشد فیبروبلاست (FGF) در تنظیم هوموستاز هر دو غضروف مفصلی و دیسک بین مهره‌ای نقش دارد (19). با این‌حال، نتایج مطالعات مختلف در مورد نقش آنابولیک و کاتابولیک  FGF-2در هموستاز غضروف مفصلی، ضد و نقیض بود (3). به‌ عنوان مثال FGF-2 پس از آسیب دیدگی یا فشرده سازی مکانیکی ECM آزاد می‌گردد و اثرات محافظتی و مفیدی را در مفاصل موش‌ها ایجاد می‌کند. البته در موش‌های فاقدFGF-2  میزان استئوآرتریت افزایش یافت (با افزایش سن و بی ثبات کردن مفصل) و در برخی مدل‌های تحقیقاتی با تزریق زیر جلدی FGF-2 معکوس شد (4). در همان مدل، موش‌های بدون استفاده از FGF-2 یک القاء فوق العاده از ADAMTS-5 mRNA را نشان دادند و نتایج این تحقیق نشان داد که FGF-2 به‌طور معمول از فعالیت آنزیم آگرگاناز جلوگیری می‌کند البته الاستاز‌، کلاژناز و آگرگانازاز آنزیم‌های مخرب سطوح مفصلی هستند که FGF-2  می‌تواند از تخریب غضروف مفصلی جلوگیری کند (20). برخی دیگر استفاده از FGF-2 را سبب احیاء و ترمیم غضروف می‌دانند (21). در مقابل محققان دیگری نقش کاتابولیک و یا ضد آنابولیک FGF-2 را در هموستاز غضروف مفصلی نشان داده‌اند (3، 5، 6). در غضروف مفصلی بزرگسالان،FGF-2  از طریق تنظیم MMPs وagrecanases  و هم‌چنین تحریک گونه‌های اکسیژن فعال مانند نیتریک اکسید و آنیون سوپر اکسید سبب تخریب مفاصل می‌گردد و ممکن است باعث تسریع تخریب غضروف گردد (3، 5). در هر دو سلول‌های غضروف مفصلی و کندروسیت‌های منیسک‌،FGF-2  باعث تغییر نسبت بین کلاژن نوع II و نوع I می‌گردد و بهطور بالقوه باعث تشکیل فیبروکارتیلاژ می‌شود و هم‌چنین، یک جایگزین نامناسب برای غضروف هیالین خواهد بود (8). علاوه بر این، FGF-2  اثرات آنابولیک هم‌افزایی IGF-1 و BMP-7 را از طریق پروتئین کینازC δ (PKCδ)  و هم‌چنین فعالسازی وابسته به چندین کیناز MAP متعدد (ERK1 / 2، P38و (JNK در سلول‌های غضروفی مفصلی انسان در بزرگسالان را مهار می‌کند (5). FGF-2 هم‌چنین مسیر NFκB را فعال و سبب تحریک رونویسی MMP-13 می‌گردد (2) در این تحقیق استئوآرتریت موجب افزایش FGF2 در گروه شم گردید و تمرینات استقامتی و سلول‌های بنیادی نیز موجب کاهش سطح FGF2گردید که البته به سطح معناداری نرسید. لی و همکاران (2017) در پژوهشی به بررسی نقش اثرات بیولوژیکی گونه‌های FGF-2 در غضروف مفصلی پرداختند. در غضروف مفصلی انسان، FGF-2 نقش کاتابولیک و ضد آنابولیک در هموستاز غضروف و هم‌چنین تخریب و آرتروزرا دارد. در مفاصل موش،  FGF-2 به ‌عنوان یک واسطه آنابولیک شناخته شده است و به ‌عنوان فرسایش ژن FGF-2 حساسیت بیشتری به استئوآرتریت نشان‌داده است. نتایج این تحقیق نشان داد که تفاوت‌های اساسی در پاسخ‌های سلولی بین بافت‌های انسانی و موش ممکن است برای الگوهای بیان متمایز FGFR در حضور FGF-2  باشد. البته تحقیقات نشان دادکه باید در زمینه اثر متقابل FGFR ها و آبشارهای سیگنالینگ پایین دست ناشی استفاده FGF-2  در غضروف انسان محتاط بود (22). اخیراً، یان و همکاران اظهار داشتند که نقش‌های متضاد FGF-2 ممکن است به تفاوت گیرنده‌های FGF در بافت‌ها بستگی داشته باشد که از طریق اعضای چهار گیرندهFGFR1-4  منتقل می‌گردد (6، 23). تحقیقات نشان داد که غضروف مفصل زانو در انسان عمدتاً FGFR1  و FGFR3 را با سطح قابل‌توجهی از FGFR2 و FGFR4  بیان می‌کند. هم‌چنینFGFR  مسئول بسیاری از پیامدهای بیولوژیکی منفی پس از تحریک با  FGF-2است و سبب تنظیم مجدد MMP-13 و مهار تجمع پروستاگلاندین‌ها می‌گردد (5). در واقع، در غضروف تخریب شده، یک افزایش نسبت FGFR1  به FGFR3 وجود دارد که نقش غالب مسیر FGF-2-FGFR1  در تخریب غضروفها را نشان میدهد. از طرف دیگر، FGFR3 بعد از اتصال لیگاند توسط FGF-18، نقش آنابولیکی دارد، و سبب تحریک قوی سنتز پروستاگلاندین می‌گردد (7). این یافته‌ها اثرات متضاد مهم FGFR1 و FGFR3 را در غضروف مفصلی انسان نشان می دهد. به عنوان مثال، در غضروف موش، FGF-2 اثرات آنابولیک را نشان می‌دهد (4). در حالی که به نظر می رسد نقش آن در غضروف مفصلی انسان کاتابولیک و ضد آنابولیک است (5، 3). بر اساس تحقیقات یان و همکاران این احتمال وجود دارد که تفاوت‌های خاص گونه‌ها (یعنی موش‌ها در مقابل غضروف انسان) پس از تحریک با FGF-2  احتمالاً با تغییر سطح بیان FGFR همراه است (6). هم‌چنین نتایج این تحقیق نشان داد که سطح تغییرات بیان ژن  MMP13در گروه شم نسبت به گروه سالم افزایش معناداری داشت؛ در حالی که تمرینات بدنی و سلول‌های بنیادی موجب کاهش معنادار سطح MMP13 در گروه‌های تجربی شد. نشانگرهای زیستی که مربوط به شروع تخریب غضروف مفصلی در مرحله اولیه استئوآرتریتاست، این موارد شامل تعدادی آنزیم تخریب‌کننده ماتریس، مانند خانواده متالوپروتئیناز ماتریکس(MMP) ، خانواده متالوپروتئیناز با ترومبوسپوندین نوع 1(ADAMTS) ، اگر یکان‌ها و غیره است (9). از بین این پروتئینازها‌، توجه به MMP-13 معطوف شده است زیرا در مفاصل و غضروف مفصلی در بیماران مبتلا به OA به‌طور چشمگیری بیان شده است و به سختی در بافت‌های عادی بزرگسالان قابل تشخیص است.  MMP-13 به‌عنوان یک آنزیم تخریب کننده ماتریکس خارج سلول (ECM) در اتصالات OA  عمل می‌کند (24).  MMP-13 از لحاظ نقش آن در غضروف، بیشترین مورد مطالعه در مورد متالوپروتئینازهای ماتریکسی است، زیرا به‌دلیل توانایی شدید آن در برش دادن کلاژن نوعII ، عامل اصلی کاتابولیک در استئوآرتریت محسوب میگردد (25). نتایج یک تحقیق نشان داد که در یک مدل OA  آزمایشی در موش با استفاده از تکنیک میکروسکوپی‌، سطح MMP-13  با حضور سلول‌های غضروفی پاتولوژیک که در مرحله اولیه توسعه OA تحت تمایز هایپرتروفیک قرار می‌گیرند ارتباط دارد و بیان بیش از حد آن می‌تواند از طریق افزایش تخریب بیش از حد ECM سبب استئوآرتریت اولیه گردد (1). در نمونه‌های بالینی‌ MMP-13 به‌طور غیرطبیعی در مراحل مختلف فرایند استئوآرتریت بیان شد و در مرحله اولیه تنظیم افزایشی نشان داد ولی در اواخر OA غضروف انسانی تنظیم کاهشی نشان داد. بنابراین از آنجا که MMP-13 یک نقش مرکزی در شبکه تخریب غضروف دارد (10). با این وجود MMP-13  به‌ عنوان عامل اصلی تخریب غضروف در استئوآرتریت و مشهودترین و مفیدترین کاندیدای متالوپروتئینازهای ماتریسی به‌عنوان یک نشانگر مهم در این بیماری است. به نظر می‌رسد بیان ژن MMP-13 از طریق تعدادی از مسیرهای مولکولی و از طریق التهاب وارد عمل می‌گردد. یمانی و لوسر (2014) نشان دادند که Nupr1، که در غضروف بیان شده است، برای بیان MMP-13 از طریق آزاد‌سازی IL-1  است (13). در حالیکه این محققان چندین ژن مرتبط با تنظیم MMP را شناسایی کردند، غالب آن‌ها با التهاب همراه بودند. سوگیتا و همکاران (2015) گزارش دادند که فاکتور رونویسی مویی و تقویت کننده اسپلیت 1 (Hes1) در تنظیم بیشتر بیان MMP-13 نقش دارد (26). معمولاً Hes1 به عنوان یک سرکوب گر رونویسی عمل می‌کند اما تحت تأثیر آن پروتئین کیناز 2 وابسته به کلسیم/ کالمودولین(CaMK2)  آن را به یک فعال‌کننده رونویسی تبدیل می‌شود، بنابراین بیان MMP-13  را تنظیم میکند (27). بنابراین Hes1 برای افزایش بیان MMP-13 عمل می‌کند. جالب است بدانیم که Hes1 از طریق مسیر سیگنالینگ Notch عمل می‌کند (28). هوچبرگ و همکاران (2019) در پژوهشی به بررسی بینش جدید در خصوص شبکه تنظیمی MMP-13 در پاتوژنز استئوآرتریت اولیه پرداختند. از بین این پروتئینازها‌، متالوپروتئیناز ماتریس 13 (MMP-13) بیشترین توجه را به خود جلب کرده است‌، زیرا این یک گره مرکزی در شبکه تخریب غضروف است.MMP-13 و شبکه‌های نظارتی آن اهداف مناسبی برای توسعه استراتژی‌های درمانی زودرس برای پیشگیری و درمان استئوآرتریت محسوب می‌گردد (29).
نتیجه گیری
نتایج تحقیق حاضر نشان داد که استئوآرتریت موجب افزایش سطوحFGF2  و MMP13 در بافت غضروف موش‌های مبتلا به استئوارتریت شد و تمرینات استقامتی به همراه سلول‌های بنیادی موجب ایجاد روند کاهشی در سطح مقادیر فاکتورهای مورد نظر شد. موارد فوق نشان می‌دهد که FGF2 و MMP13 می‌توانند اهداف مناسبی برای توسعه استراتژی‌های درمانی تشخیص زودرس برای OA باشند.
سپاس‌گزاری
این مقاله حاصل نتایج پایان نامه دانشجویی دانشگاه آزاد اسلامی واحد آیت الله آملی می‌باشد که از دانشگاه مذکور و تمامی عوامل دخیل و همکار در دانشگاه آزاد اسلامی واحد ساری تشکر می‌شود.
حامی مالی: ندارد.
تعارض در منافع: وجود ندارد.
 
 

References:
 
1-    Nugent M. Micrornas: Exploring New Horizons in Osteoarthritis. Osteoarthr Cartil 2016; 24(4): 573-80.
2-    Muddasani P, Norman JC, Ellman M, Van Wijnen AJ, Im Hee-Jeong. Basic Fibroblast Growth Factor Activates the MAPK and Nfkappab Pathways that Converge on Elk-1 to Control Production of Matrix Metalloproteinase-13 by Human Adult Articular Chondrocytes. J Biol Chem 2007; 282(43): 31409-21.
3-    Ellman MB, An HS, Muddasani P, Im HJ. Biological Impact of the Fibroblast Growth Factor Family on Articular Cartilage and Intervertebral Disc Homeostasis. Gene 2008; 420: 82-9.
4-    Chia SL, Sawaji Y, Burleigh A, Mclean C, Inglis J, Saklatvala J,et al. Fibroblast Growth Factor 2 is an Intrinsic Chondroprotective Agent that Suppresses ADAMTS-5 and Delays Cartilage Degradation in Murine Osteoarthritis. Arthritis Rheum 2009; 60(7): 2019-27.
5-    Im HJ, Li X, Muddasani P, Kim GH, Davis F, Rangan J,et al. Basic Fibroblast Growth Factor Accelerates Matrix Degradation via a Neuro-Endocrine Pathway in Human Adult Articular Chondrocytes. J Cell Physiol 2008; 215(2): 452-63.
6-    Yan D, Chen D, Cool SM, Van Wijnen AJ, Mikecz K, Murphy G, et al.Fibroblast Growth Factor Receptor 1 is Principally Responsible for Fibroblast Growth Factor 2-Induced Catabolic Activities in Human Articular Chondrocytes.Arthritis Res Ther 2011; 13(4): R130.
7-    Davidson D, Blanc A, Filion D, Wang H, Plut P, Pfeffer G,et al. Fibroblast Growth Factor (FGF) 18 Signals through FGF Receptor 3 to Promote Chondrogenesis. J Biol Chem 2005; 280(21): 20509-15.
8-    Stewart K, Pabbruwe M, Dickinson S, Sims T, Hollander AP, Chaudhuri JB. The Effect of Growth Factor Treatment on Meniscal Chondrocyte Proliferation and Differentiation on Polyglycolic Acid Scaffolds. Tissue Eng 2007; 13(2): 271-80.
9-    Matyas J, Atley L, Ionescu M, Eyre D, Poole A. Analysis of Cartilage Biomarkers in the Early Phases of Canine Experimental Osteoarthritis. Arthritis Rheum 2004; 50(2): 543-52.
10-    Philipot D, Guerit D, Platano D, Chuchana P, Olivotto E, Espinoza F,et al. P16ink4a and its Regulator Mir-24 Link Senescence and Chondrocyte Terminal Differentiation-Associated Matrix Remodeling in Osteoarthritis.Arthritis Res Ther 2014; 16(1): R58.
11-     Galois L ,  Etienne S,  Grossin L,  Watrin-Pinzano A, Cournil-Henrionnet C,  Loeuille D,et al..Dose–Response Relationship for Exercise on Severity of Experimental Osteoarthritis in Rats: A Pilot Study. Osteoarthritis Cartilage 2004; 12(10): 779-86.
12-     Cifuentes  DJ,  Rocha LG,  Silva LA,  Brito AC,  Rueff-Barroso CR,  Porto LC, et al .Decrease in Oxidative Stress and Histological Changes Induced by Physical Exercise Calibrated in Rats with Osteoarthritis Induced by Monosodium Iodoacetate. Osteoarthritis Cartilage 2010; 18(8): 1088-95.
13-    Ezadpanah A, Moazami M, Khoshraftar Yazdi N. Effect of a Period of Therapeutic Exercise and Detraining after that on Balance in the Women with Knee Osteoarthritis. J Mod Rehabil 2016; 93(3): 101-9. [Persian]
14-    Ramezani M, Nekozad N. Comparison between the Effectiveness of Glucosamine Sulfate and Zintoma on Clinical Improvement of Knee Osteoarthritis. Ebnesina 2011; 14(3): 29-34. [Persian]
15-    Centeno C, Sheinkop M, Stemper I, Williams C, Hyzy M, Ichim T,et al. A Specific Protocol of Autologous Bone Marrow Concentrate and Platelet Products versus Exercise Therapy for Symptomatic Knee Osteoarthritis a Randomized Controlled Trial with 2 Year Followup. J Transl Med 2018; 16: 355.
16-    Ratajczak M. Advances in Experimental Medicine and Biology, Stem Cells Therapeutic Applications, Springer. 2019. Available at: https:// www.springer.com/ gp/ book/ 9783030312053. Accessed April 9, 2021.
17-    Askari F, Solouk A, Shafieian M, Seifalian AM. Stem Cells for Tissue Engineered Vascular Bypass Grafts. Artif Cells Nanomed Biotechnol 2017; 45(5): 999-1010.
18-    Yammani RR, Loeser RF. Stress-Inducible Nuclear Protein 1 Regulates Matrix Metalloproteinase 13 Expression in Human Articular Chondrocytes. Arthritis & Rheumatology 2014: 66(5); 1266-71.
19-    Friedl A, Chang Z, Tierney A, Rapraeger AC. Differential Binding of Fibroblast Growth Factor-2 and -7 to Basement Membrane Heparan Sulfate: Comparison of Normal and Abnormal Human Tissues. Am J Pathol 1997; 150: 1443-55.
20-    Little CB, Barai A, Burkhardt D, Smith SM, Fosang AJ, Werb Z, et al. Matrix Metalloproteinase 13-Deficient Mice are Resistant to Osteoarthritic Cartilage Erosion but Not Chondrocyte Hypertrophy or Osteophyte Development. Arthritis Rheum 2009; 60(12): 3723-33.
21-    Deng T, Huang S, Zhou S, He L, Jin Y. Cartilage Regeneration Using A Novel Gelatin-Chondroitinhyaluronan Hybrid Scaffold Containing Bfgf-Impregnated Microspheres. J Microencapsul 2007; 24(2): 163-74.
22-    Li H, Wang D, Yuan Y, Min J. New Insights on the MMP-13 Regulatory Network in the Pathogenesis of Early Osteoarthritis. Arthritis Res Ther 2017; 19(1): 1-2.
23-    Ornitz DM. Fgfs, Heparan Sulfate and Fgfrs: Complex Interactions Essential for Development. Bioessays 2000; 22: 108-12.
24-    Knauper V, Cowell S, Smith B, Lopez-Otin C, O'Shea M, Morris H. The Role of the C-Terminal Domain of Human Collagenase-3 (MMP-13) in the Activation of Procollagenase-3, Substrate Specificity, and Tissue Inhibitor of Metalloproteinase Interaction. J Biol Chem 1997; 272(12): 7608-16.
25-    ShiomiT, Lemaître V, D’Armiento J, Okada Y. Matrix Metalloproteinases, a Disintegrin and Metalloproteinases, and a Disintegrin and Metalloproteinases with Thrombospondin Motifs in Non-Neoplastic Diseases.Pathol Int 2010; 60(7): 477-96.
26-    Sugita S, Hosaka Y, Okada K, Mori  D, Yano F,Kobayashi H,et al.Transcription Factor Hes1 Modulates Osteoarthritis Development in Cooperation with Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase 2.Proc Nat Acad Sci U S A 2015; 112(10): 3080-85.
27-    Ju BG, Solum D, Song EJ, lee KJ, Rose DW, Glass CK, et al. Activating the PARP-1 Sensor Component of the Groucho/ TLE1 Corepressor Complex Mediates a Camkinase II-Dependent Neurogenic Gene Activation Pathway. Cell 2014; 119(6): 815-29.
28-    Kageyama R, Ohtsuka T, Kobayashi T. The Hes Gene Family: Repressors and Oscillators that Orchestrate Embryogenesis.Development 2007; 134(7): 1243-51.
29-    Sarav S, MithoeferK. Current Applications of Growth Factors for Knee Cartilage Repair and Osteoarthritis Treatment.Curr Rev Musculoskelet Med 2020; 13(6): 641-50.