fa همسانه‌سازی و بیان ایمونوتوکسین اونتاک به صورت هیبریدی با دنباله اینتئینی ژنتیک Genetics پژوهشي Original article <p dir="RTL"><strong>مقدمه:</strong> اینتئین‌ها بخش‌های درونی در برخی پروتئین‌های مخمری و یوکاریوت‌های تک سلولی هستند که می‌توانند در فرآیند پیرایش پروتئین‌ها از مابقی پروتئین جدا شوند. بعد از شناسایی مکانیسم عملکرد اینتئین‌ها، کاربرد این توالی‌ها در تخلیص تک مرحله‌ای پروتئین‌های نوترکیب مورد توجه قرار گرفته و دنباله‌های خود برشگر اینتئینی مختلفی گسترش یافتند. مزیت روش<br> کاربرد دنباله‌های اینتئینی برای تخلیص پروتئین‌ها نسبت به بقیه روش‌های تخلیص پروتئین، عدم احتیاج به آنزیم‌های پروتئازی و مراحل حذف پروتئاز می‌باشد که این روش را از لحاظ اقتصادی حائز اهمیت می‌کند. در این مطالعه، ژن به رمز درآورنده<br> <span dir="LTR">Denileukin Diftitox</span> (با نام تجاری اونتاک،<span dir="LTR">Ontak</span>) بصورت مولکولی با دنباله اینتئینی تلفیق گردید و میزان بیان آن در پلاسمید <span dir="LTR">pTXB1</span> مورد بررسی قرار گرفت.</p> <p dir="RTL"><strong>روش بررسی:</strong> در این مطالعه، بر اساس جایگاه‌های چندتایی همسانه‌سازی(<span dir="LTR">MCS</span>) وکتور <span dir="LTR">pTXB1</span>، پرایمرهای مناسب طراحی شدند و پس از تکثیر قطعه کدکننده اونتاک، همسانه‌سازی با استفاده از آنزیم‌های <span dir="LTR">NdeI</span> و <span dir="LTR">SapI</span> انجام گرفت. این سازه نوترکیب<span dir="LTR">(PTX-IDZ)</span> به سلول‌های <span dir="LTR">E.coli</span> سویه <span dir="LTR">ER2566</span> ترانسفورم گردید و بیان اونتاک مورد مطالعه قرار گرفت.</p> <p dir="RTL"><strong>نتایج:</strong> همسانه‌سازی توالی اونتاک در تلفیق با دنباله اینتئینی در وکتور بیانی <span dir="LTR">pTXB1</span> توسط <span dir="LTR">PCR</span> و برش آنزیمی تائید شد. بیان پروتئین نوترکیب با روش <span dir="LTR">SDS-PAGE</span> آنالیزو با روش لکه گذاری وسترن تائید گردید.</p> <p dir="RTL">نتیجه‌گیری: جایگاه آنزیم محدودکننده <span dir="LTR">SapI</span> در محل تلفیق توالی اونتاک با دنباله اینتئینی عدم ورود هیچ اسید آمینه اضافه‌ای را در پروتئین هدف، تضمین می‌نماید. همچنین بیان ایمونوتوکسین اونتاک در این سازه نسبت به بیان این پروتئین به صورت تلفیق شده با دنباله هیستیدینی ارزیابی گردید. با توجه به بیان مناسب پروتیئن اونتاک، در مراحل بعدی، تخلیص تک مرحله‌ای پروتئین دارویی اونتاک انجام خواهد گرفت.</p> <p><strong><em>Introduction:</em></strong> Inteins (INT) are internal parts of a number of proteins in yeast and some other unicellular eukaryotes, which can be separated from the immature protein during protein splicing process. After identifying the mechanism of intein action, applications of these sequences are be considered in the single- step purification of recombinant proteins and different intein tags were developed. The most important advantage of using intein tags in purification of recombinant proteins than other affinity tags is no requirement of expensive protease enzymes and following additional steps to remove protease that make intein tags economically are considered more important. In the present study, denileukin diftitox immunotoxin (brand name Ontak), be fused with an intein tag and it was inserted in pTXB1 plasmid.</p> <p><strong><em>Methods: </em></strong>In this study, with respect to multiple cloning sites (MCS) of pTXB1, specific primers were designed. Polymerase Chain Reaction (PCR) was performed and encoding sequence of ONTAK was cloned using restriction sites of NdeI and SapI. Recombinant vector (PTX-IDZ) was transformed into E. coli strain ER2566 and expression of gene was studied.</p> <p><strong><em>Results:</em></strong> The accuracy of recombinant construct was confirmed by PCR and enzymatic digestion. The produced recombinant proteins were confirmed by SDS-PAGE and Western blotting.</p> <p><strong><em>Conclusion:</em></strong> Restriction site of SapI guarantees no additional residues incorporate in primary protein sequence. Also, the expression of this construct was analyzed in compare with fused protein to poly-His tag. According to the appropriate expression of fused protein in both constructs it was expected that one step- purification of considered drug protein will be success in the following steps.</p> اینتئین, ایمونوتوکسین‌ها, همسانه‌سازی, پروتئین‌های نوترکیب Intein, Immunotoxins, Cloning, Recombinant Proteins 232 240 http://jssu.ssu.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-2562-1&slc_lang=fa&sid=1 SA Moosavizadeh سیدعلی موسوی زاده محمدآباد seiedalim65@yahoo.com No Mallek Ashtar University of Technology پژوهشکده علوم و فناوری زیستی M zeinodini مهدی زین الدینی zeinoddini52@mut.ac.ir Yes Mallek Ashtar University of Technology پژوهشکده علوم و فناوری زیستی AR Saeeidinia علیرضا سعیدی نیا a.saeedinia@mut.ac.ir No Mallek Ashtar University of Technology پژوهشکده علوم و فناوری زیستی MA Nasiri Khlili محمدعلی نصیری خلیلی nasiri@mut.ac.ir No Mallek Ashtar University of Technology پژوهشکده علوم و فناوری زیستی