ماهنامه علمی پ‍ژوهشی

مقدمه
سرطان تخمدان، یک تومور اپیتلیال تهاجمی، همچنان یکی از علل اصلی مرگ و میر ناشی از سرطان در زنان است و باعث مرگ و میر بیشتر از هر سرطان دستگاه تناسلی زنان می‌شود. اکثر بیماران مبتلا به سرطان تخمدان در مرحله پیشرفته بیماری تشخیص داده می‌شوند و علیرغم پیشرفت استراتژی‌های جراحی و شیمی‌درمانی، میزان بقای 5 ساله کمتر از 25٪ است (1). این بیماری معمولاً در زنان یائسه با چند ماه درد و اتساع شکم ظاهر می شود (2). روش¬های درمان انواع مختلف سرطان به مراحل پاتولوژیک آن بستگی دارد. تشخیص زودهنگام به درمان کمک می کند. روش‌های درمانی فعلی، ترکیبی از جراحی و دارو درمانی و پرتودرمانی است که اثرات بعد از درمان ممکن است بیمار را تحت تاثیر قرار دهد. با توجه به اثرات مضر عوامل شیمیایی، اخیراً داروهای گیاهی با خواص منحصربه فرد مانند ارزان، طبیعی و در دسترس بودن و بدون هیچ‌گونه عوارض جانبی قابل‌توجهی، مورد پذیرش قرار گرفته است در حال حاضر تلاش برای یافتن روش‌های درمانی جایگزین و داروهای ضدسرطان ادامه دارد. ترکیبات فعال از داروهای گیاهی، مانند کورکومین، در برابر سرطان موثر هستند. (3, 4). گونه گیاه دافنه با نام علمی. Daphne mucronata Royle درختچه‌ای همیشه سبز از خانواده Thymelaeaceae که تقریباً از 90 گونه تشکیل شده است و بومی پاکستان است این گیاه در برخی از مناطق کوهستانی ایران یافت می شود. عصاره برگی دافنه دارای خواص ضد باکتریایی و ضد قارچی بوده و دارای ترکیباتی نظیر فلاونوئیدها، کومارین‌ها، کورستین، کاتچین‌ها و اسید فرولیک هستند. (5-7). اثرات ضد تکثیری 6 نوع عصاره برگی از گیاه Daphne altaica  در چهار رده سلول سرطانی انسان شامل سرطان مری، معده، هپاتوم و دهانه رحم، مورد بررسی قرار گرفته و نتایج نشان داده است که همه عصاره‌ها بجز عصاره آبی، دارای اثر بازدارندگی در همه رده¬های سلولی مورد آزمایش داشته است. (8). پژوهشی با هدف بررسی فعالیت سیتوتوکسیک دو عصاره هیدروالکلی و کلروفرمی D. mucronate بر روی هفت رده سلولی مختلف شامل رده¬های سلولی SK-Br-3‌، MDA-MB-435، Hela‌، K562 ، U937، Ag.8 و Vero مورد بررسی قرار گرفته است و نشان داده است که بیشترین فعالیت بازدارندگی مربوط به عصاره هیدروالکلی D. mucronata روی رده‌های سلولی سرطان پستان می باشد (9). شانگ و همکاران اثر عصاره گیاه D. giraldii را روی رده سلولی سرطان کبد آزمایش و فعالیت سیتوتوکسیک آن را مشاهده کرد و نشان دادند که این ماده باعث توقف سلول در G0/G1 و کاهش بیان سیکلین E1، CDK2 و CDK4 و برش کاسپاز 3 و PARP در سلول‌های Hep3B و HepG2 می‌‌‌شود. (10). در مطالعات بعدی نشان داده شد که فلاونوئید موجود در عصاره گیاه D.  giraldii باعث القای استرس اکسیداتیو و نیتروزاتیو می‌شود که در سلول‌‌‌های Hep3B و HepG2 منجر به افزایش آپوپتوز با واسطه p38 می‌شود (11). در سال 2016 گروهی از محققان اثر ضد سرطانی فلاونوئیدهای کل در D. genkwa بر روی سلول‌های سرطان کولورکتال انسانی HT-29 و SW-480 موش مورد بررسی قرار گرفت. نتایج آزمایش سلولی نشان داد که عصاره این گیاه دارای اثرات مهاری قابل‌توجهی بر سلول‌های سرطانی فوق داشته است و بیان ژن های مرتبط با اینترلوکین (IL)-1α، IL-1β، IL-6 (عامل محرک کلنی گرانولوسیت) بافت روده با کاربرد این عصاره کاهش یافته است (12). با توجه به بررسی منابع انجام شده، نقش موثر این گیاه در درمان بیماری های سرطانی به اثبات رسیده است ولی تاثیر آن بر روی رده سلولی سرطان رحم در بررسی منابع دیده نشد. بدین جهت تلاش شد تا اثر کشندگی عصاره هیدروالکلی عصاره دافنه بر روی زنده مانی سلول های سرطانی رده A2780S و بررسی بیان ژن MAPkinase8  و PK2 در سلول های تیمار شده با عصاره در 3 بازه زمانی 24، 48 و 72 ساعت مورد بررسی قرار گیرد.
روش بررسی
در این پژوهش آزمایشگاهی، از سلول های سرطان تخمدان انسان (رده سلولی A2780s) خریداری شد. از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران استفاده شد. از محیط کشت DMEM High Glucose (4/5 گرم در لیتر) همراه با ال آلانین جهت بازیابی و کشت مجدد سلول ها استفاده شد. از تریپسین برای جدا کردن سلول‌ها از کف فلاسک استفاده شد. کشت سلولی مرتب بازبینی وقتی که تراکم سلول‌ها به بیش از 70 درصد رسید پاساژ سلولی انجام گردید. جهت تهیه عصاره گیاهی در ابتدا مقدار تفریبی تقریباً 100 گرم بافت برگی خشک شده گیاه دافنه برای تهیه عصاره الکلی مورد استفاده قرار گرفت. برگها بوسیله هاون چینی سائیده و پودر حاصل درون کاغذ صافی مخروطی شکل ریخته و تمام محتویات را درون دستگاه سوکسله حاوی300 میلی‌لیتر محلول هیدروالکلی 20 درصد قرار داده شد. عمل تبخیر و تقطیر انجام و در پایان عصاره غلیظ شده گیاه دافنه تهیه گردید. میزان 4 میلی گرم از عصاره به‌دست آمده در یک میلی‌‌لیتر آب جهت تهیه غلظت اولیه (استوک) مورد استفاده قرار گرفت. سپس رقت‌های 5، 50، 100، 200، 500، 1000 و 1500 میکروگرم بر میلی-لیتر با محیط کشت 10 درصد استفاده شده در آزمایش (مواد و روش‌ها) تهیه گردید. عصاره‌های بدست امده با استفاده از فیلتر سر سرنگی0/22 میکرومتری، استریل و در ویال های جداگانه نگهداری شدند. برای بررسی تاثیر عصاره دافنه بر زنده‌مانی سلول‌های سرطان رحم ردهA2870s  و تعیین غلظتی از عصاره که موجب از بین رفتن 50 درصد از سلول‌ها می‌‌شود (IC50) از روش سنجش MTT استفاده شد. بدین منظور در ابتدا محلول MTT با غلظت mg/ml5، ( 0/02 گرم از پودر تترازولیوم/ 4 میلی لیتر (PBS تهیه و در فالکون با جداره تاریک نگهداری گردید.
 


جهت سنجشMTT، در ابتدا مقدار 100 میکرولیتر از سلول های تازه (حاوی 104 سلول/ میلی‌لیتر) درون چاهک های سینی 96 تایی ریخته و در داخل انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی گراد (رطوبت 95% و Co2 5%) قرار داده شد تا سلول های به خوبی تثبیت شوند. بعد از سپری شدن 24 ساعت مقدار ١٠٠ میکرولیتر از رقت¬های مختلف عصاره تهیه و در هر جاهک ریخته شد (به‌جز چاهک‌های کنترل). برای تیمار کنترل 100 میکرولیتر سلول و محیط کشت و برای تیمار بلانک 200 میکرولیتر محیط کشت بدون سلول ریخته شد و در نهایت، پلیت‌ها داخل انکوباتور (با شرایط فوق). قرار داده و بسته به زمان سنجش MTT(48،24و72ساعت) از انکوباتور خارج شدند. پس از گذشت زمان مورد نظر (مثلاً 24 ساعت)، محیط روی سلول‌ها خارج و 20 میکرولیتر محلول (5 میلی‌گرم/میلی لیتر) MTT به هر چاهک‌ اضافه ریخته و سینی ها داخل یک فویل آلومینیوم پیچیده و به مدت 4 ساعت داخل انکوباتور قرار داده شد. برای حل کریستال¬های فورمازان در سلول¬های زنده مقدار150 میکرولیتر DMSO به هر چاهک اضافه شد و پس از 15 دقیقه، پلیت میزان تغییر رنگ با استفاده از دستگاه الایزا خوان با طول موج 570 نانومتر خوانده شد. نتایج حاصل وارد فایل اکسل و مقدارا IC50 محاسبه شد. بررسی میزان بیان ژن در سلول های تیمار شده با غلظت های مختلف عصاره و مقایسه آنها با سلول های تیمار نشده استخراج RNA توسط کیت SinaPure TM RNa (SinaClon, iran) انجام شد. از آنزیم DNase I جهت از بین بردن مولکول های DNA استفاده شد و در آخر کمیت و کیفیت مولکول های به‌دست آمده به‌ترتیب با استفاده از دستگاه نانودراپ و الکتروفورز ژل آگارز مورد ارزیابی قرار گرفت. سنتز cDNA توسط cDNA synthesis kit برند یکتاتجهیز انجام شد. برای اطمینان از ساخت مولکول های cdNA، با استفاده از آغازگر ژن مورد نظر تکثیر مولکول های cDNA انجام و محصول PCR با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز و با استفاده از دستگاه Gel document مشاهده شد. cDNA تولیدی تا زمان بررسی بیان ژن در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری شد. سنتز آغازگرهای مورد نیاز در تکثیر قطعات ژنی، در ابتدا توالی ژن-های MAPK8,PTK2 و GAPDH از پایگاه داده Ensemble گرفته شد و سپس به‌وسیله نرم‌افزار Gene Runner طراحی آغازگرها انجام شد. احتمال تشکیل ساختار ثانویه و دایمر با استفاده از نرم‌‌افزار Oligo Analyzer بررسی و سپس با استفاده از پایگاه داده UCSC/In silico PCR شبیه‌سازی PCR انجام شد. و اختصاصی بودن آغازگرها با استفاده از NCBI/Primer Blast مورد تائید قرار گرفت. مشخصات آغازگرهای مورد استفاده در این تحقیق در جدول 1 درج شده است.
 

جدول 1: مشخصات توالی آغازگرهای مورد استفاده در بررسی میزان بیان ژن‌های PTK2 و MAPK8


 

 
آنالیز بیان ژن های مورد نظر در این آزمون با استفاده از روش qRT-PCR و با استفاده از دستگاه لایت سایکل(Rotor-Gene, Qiagene, Germany)  انجام گردید. در این پژوهش از SYBR Green master mix برند یکتاتجهیز آزما و از دستگاه Real-time PCR مدل استفاده شد. مخلوط واکنش qRT-PCR به حجم 25 میکرولیتر شامل، 8 میکرولیترSYBR Green master mix (Pishgam, Iran)  ، 1 میکرولیتر آغازگر رفت و 1 میکرولیتر آغازگر برگشت ( 10 پیکومولار) ، 3 میکرولیتر از مولکولهی cDNA و 12 میکرولیتر آب مقطر دیونیز استریل بود که در زیر هود بیولوژیکی آماده گردید. مراحل شرایط دمایی و زمانی شامل دمای واسرشتگی (Denaturation) ا ولیه 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه و سپس برای 38 چرخه دمای واسرشتگی 95 درجه سانتی گراد، دمای ذوب و اتصال آغازگر 60 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه و دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه جهت بسط قطعات تکثیری استفاده گردید. از مخلوط واکنش بدون توالی هدف به عنوان کنترل منفی استفاده گردید. آنالیز داده‌های به‌دست آمده از روش MTT assay با استفاده از نرم‌افزار Graphpad Prism version 8.4.3 استفاده شد. تجزیه و تحلیل داده¬های مربوط به غلظت بهینه (IC50) با استفاده از آزمون Anova و مقایسه اثر غلظت‌های مختلف دارو در زمان‌های مختلف با استفاده از تست Tukey انجام شد. داده های حاصل از بیان ژن با استفاده از روش Ct∆∆ آنالیز گردید. از ژن GAPDH به عنوان ژن رفرانس و نرمال سازی داده ها استفاده شد.
تجزیه و تحلیل آماری
 برای مقایسه میانگین ها از آزمون LSD استفاده گردید. رسم نمودارها‌ به‌وسیله نرم افزار Graphpad Prism انجام شد. در این پژوهش ملاک معنادار بودن تمام آنالیزها و محاسبات،‌P ≤ 0/05 در نظر گرفته شد.
نتایج
بررسی اثر عصاره دافنه به غلظت‌های مختلف و زمان‌های مختلف: در این تحقیق اثر سمیت عصاره الکلی دافنه در غلظت‌های مختلف به‌طور جداگانه و مستقل از هم در زمان‌های مختلف با استفاده از روش‌های آماری و آنالیز تنوعات یا ANOVA مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج به‌دست آمده غلظت‌های مختلف عصاره دافنه بر روی میزان زنده‌مانی سلول‌های A2780s اثر معنی‌دار داشته است که نشان‌دهنده وابستگی اثر عصاره دافنه به غلظت می‌باشد. زمان‌های متفاوت نیز اثر معنی‌داری بر روی میزان زنده‌مانی سلول‌ها داشته‌اند که بیانگر وابستگی اثر عصاره دافنه به زمان نیز بوده ‌است. همچنین بررسی اثر غلظت و زمان به‌صورت همزمان نیز بر روی میزان زنده‌مانی سلول‌ها اثر معنی‌داری را گزارش نمود.
محاسبه IC50 عصاره گیاه دافنه در زمان‌های مختلف بر رده سلولی A2780s: بررسی زنده‌مانی سلول‌های سرطان تخمدان رده A2870s در 3 بازه زمانی 24،48 و 72 ساعت بعد از تیمار با استفاده از سنجش MTT نشان داد که تمام تیمارهای عصاره گیاه دافنه در سطوح معنی‌داری بر روی زنده‌مانی سلول ها اثر داشته‌اند. برای هر تیمار غلظتی 3 تکرار اعمال گردید و از میانگین داده های مشاهده شده (با احتساب انحراف معیار) برای رسم نمودار IC50 در نرم‌افزار Graphpad استفاده شد. رسم منحنی اثر سمیت عصاره دافنه بر روی رده سلولی با غلظتهای مختلف نشان می دهد که با افزایش غلظت عصاره گیاهی درصد زنده¬مانی سلول¬ها کاهش یافته است که شیب این تاثیر در بازه‌های زمانی 24 و 48 ساعت مشهودتر است (شکل 1).
بررسی میزان تغییرات IC50 سلول‌های تیمار شده با عصاره نشان داد که عصاره دافنه اثر معنی داری را در کشندگی سلول‌هاس تیمار شده داشته است (جدول 2). داروی دافنه بر رده A2780s در زمان‌های مختلف به صورت جدول زیر است و از این غلظت‌ها برای بررسی بیان ژن استفاده شد. نتایج حاصل از تست MTT نشان می‌دهد که بهترین غلظت برای از بین بردن نیمی از سلول‌ها در بازه‌های زمانی 24، 48 و 72 ساعت به ترتیب 105/4، 85/98 و 81/38 می‌باشد.
مقایسه مورفولوژی سلول¬های A2780s تحت تیمار در زمان‌های مختلف: تغییرات مورفولوژی سلول‌ها پس از گذشت زمان‌‌های مختلف در شکل‌‌های زیر آمده است. سلول¬های تیمار شده در مقایسه با سلول¬ها قبل از تیمار تغییرات ظاهری را نشان می دهند. سلول‌‌ها بعد از تیمار با دافنه از حالت چسبنده خارج شدند و به صورت کروی درون محیط معلق شدند و رشد آن¬ها نسبت به قبل کاهش قابل ملاحظه‌ای پیدا کرده بود.
 



شکل 1: نمودار بررسی درصد زنده‌مانی سلول‌ها با استفاده از روش MTT در غلظت‌های مختلف عصاره گیاه دافنه (1500-5 میکروگرم برمیلی¬لیتر) طی زمان‌های 24، 48 و 72 ساعت سپری شده از تیمار. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف استاندارد است.
 
جدول2: بررسی اختلاف میانگین IC50 تأثیر عصاره گیاهی بر درصد زنده‌مانی سلول‌های سرطانی، در بازه¬های زمانی 24، 48 و 72 ساعت در غلظت های 5، 50 و 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر عصاره گیاهی با استفاده از آزمون tukey



 
ns: نشان دهنده عدم معنی‌داری در سطح خطای 5 درصد و ستاره ها نشان دهنده میزان معنی‌دار بودن هستند.).





شکل 2- ‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌سلول‌های تیمار شده با عصاره دافنه در غلظت IC50 بعد از گذشت 24، 48 و 72 ساعت غلظت های مختلف عصاره گیاه دافنه بر روی سلولهای سرطان تخمدان رده A2870s در 3 بازه زمانی 24،48 و 72 ساعت بعد از تیمار
در شکل زیر کریستال‌‌های فورمازان بعد از زمان‌های مختلف مشاهده می‌‌شوند که کم کم میزان آن‌ها کاهش یافته است.





شکل3: تصویر کریستال‌های فورمازان در سلول‌های تیمار شده با عصاره دافنه در غلظت IC50  . از چپ به راست به ترتیب بعد از گذشت 24، 48 و 72 ساعت.
 
بررسی کیفیت و کمیت RNA استخراج شده: نتایج طیف‌سنجی با دستگاه نانودراپ نشان داد که مقدار عددی 260 به 280 نیز برای RNA در همه نمونه¬ها بین 8/1 تا 2/2 می‌باشد که نشان از درجه بالای RNA استخراج شده و عدم آلودگی پروتئینی می‌دهد. برای بررسی کیفیت RNA استخراج شده از ژل آگارز 2 درصد استفاده شد و هر سه باند s rRNA28، s rRNA18و s rRNA8/5 مشاهده شد که نشان دهنده کیفیت و سالم بودن RNA استخراج شده بود.
بیان ژن¬های PTK2 و MAPK8 در نمونه‌های تیمار شده با داروی دافنه و تیمار نشده (کنترل):  واکنش بررسی بیان نسبی هر ژن با استفاده از روش qRT-PCR برای تمام ژن¬ها در شرایط بیولوژیکی و تکنیکی یکسان با تکرارهای مشابه انجام و نتایج حاصل از این آزمون نشان داد که غلظت IC50 برای هر بازه زمانی بر روی بیان هر ژن تاثیرات متفاوتی را داشته است. نتایج حاصله نشان داد که بیان ژن PTK2 تحت تاثیر عصاره گیاهی قرار نگرفته و تغییرات معنی داری نسبت به تیمارهای شاهد مشاهده نشده است. همان‌طور که  در شکل 4 نشان‌داده شده است در بازه زمانی 24 ساعت بعد از تیمار، میزان بیان تقریبا با گروه کنترل یکسان بوده و در بازه‌های زمانی 48 و 72 ساعت میزان بیان ژن PTK2 دچار کاهش بسیار جزئی نسبت به تیمار کنترل بوده است ولی میزان کاهش در بازه زمانی 72 ساعت نسبت به بازه زمانی 48 ساعت بعد از تیمار بیشتر بوده است. بررسی نتایج بیان ژن MAPK8 در حالت تیمار با دافنه در سه زمان مختلف نسبت به گروه کنترل نشان داد که تیمار سلول¬‌‌ها با دافنه تغییری معنی‌دار در میزان بیان ژن MAPK8 ایجاد می¬کند. همین‌طور که از نمودار بالا مشخص شده است در گروه 24 ساعت بعد از تیمار تقریبا با گروه کنترل یکسان بوده ولی در گروه¬های 48 ساعت و 72 ساعت ، میزان بیان ژن MAPK8 دچار کاهش معنی‌داری نسبت به گروه کنترل شده است و این کاهش در زمان 72 ساعت نسبت به 48 ساعت بیشتر بوده است.
منحنی ذوب و تکثیر ژن‌ها: نتایج بررسی منحنی‌های ذوب و تکثیر ژن‌ها با استفاده از دستگاه لایت سایکر در روش Real-Time PCR نشان از اختصاصی بودن آغازگرها در تکثیر نواحی ژنی مورد نظر بوده است. عدم وجود منحنی‌های متعدد در دماهای کمتر و بیشتر تائید کننده این موضوع می‌باشد
 





شکل ‏4: نمودار بررسی میزان بیان نسبی ژن‌های PTK2 و MAPK8 در سلول های تیمار شده با عصاره دافنه در 3 بازه زمانی بعد از تیمار بر اساس غلظت بهینه IC50
 
بحث
سرطان تخمدان، یک تومور اپیتلیال تهاجمی، همچنان یکی از علل اصلی مرگ و میر ناشی از سرطان در زنان است و باعث مرگ و میر بیشتر از هر سرطان دستگاه تناسلی زنان در ایالات متحده می‌‌‌شود. استفاده از گیاهان دارویی از دیر زمان در طب سنتی توصیه شده است. جهت استفاده از گیاهان دارویی در موارد درمانی لازم است اثرات سلولی و مولکولی آن‌ها بر روی سلول‌های سرطانی و هدف در شرایط آزمایشگاه مورد بررسی قرار گیرد. بدین منظور در این مطالعه اثر عصاره هیدوالکلی و خام گیاه دافنه بر روی سلول‌‌های رده A2780s سرطان تخمدان مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج آزمون سلولی نشان داد که عصاره دافنه در ساعت‌های مختلف بعد از تیمار اثر کشندگی قابل‌ملاحظه‌ای بر روی سلول‌های هدف داشته است. پژوهش‌های زیادی در زمینه تاثیر عصاره¬های گیاهی بر روی سرطان‌های مختلف انجام شده مانند پژوهشی که در سال 2013 توسط جمعی از محققین بر روی اثر ضد سرطانی عصاره گیاه Pao pereira (Pao) روی سرطان تخمدان انجام شد و این عصاره باعث مرگ درصد بالایی از سلول‌های سرطان تخمدان شد (13) که تا حدودی با نتایج این تحقیق مطابقت نشان می‌دهد با توجه به ماهیت متشابه گیاهان با همدیگر نتایج اثر بخشی آن‌‌ها بر سلول‌‌ها می تواند تا حدودی مشابه باشد. ولی مهم‌تر از همه، مقدار ماده مورد استفاده و خالص‌سازی آن ها برای استفاده در داروسازی می باشد. به هر تقدیر نتایج این تحقیق با اغلب مطالعات مشابه مطابقت دارد. در این پایان نامه برای انتخاب غلظت های مختلف از عصاره دافنه جهت انجام تست MTT و به‌دست آوردن IC50 از بعضی مقالات مشابه استفاده شد (8). در این تحقیق مقدار غلظت IC50 در سه زمان مختلف (24، 48 و 72 ساعت) بعد از تیمار با استفاده از آزمون MTT به‌دست امد که از این غلظت ها به عنوان غلظت متعادل در بررسی بیان ژن مورد استفاده قرار گرفت. با تاثیر غلظت های مختلف از داروی دافنه بر روی سلول¬های A2780s مشاهده شد که با افزایش غلظت دارو، زنده مانی سلول ها به‌طور کاملا محسوسی کاهش می یابد. و عصاره خام دافنه باعث از بین رفتن سلول ¬های سرطان تخمدان شده است که این نتیجه با نتایج به‌دست آمده از پژوهش کیزایبک و همکارانش که 6 نوع عصاره با قطبیت مختلف از گیاه Daphne altaica  را روی 4 نوع رده سلول سرطانی انسان (کارسینوم سلول سنگفرشی مری، کارسینوم معده، هپاتوم و سلول‌های سرطان دهانه رحم) مورد آزمایش قرار دادند و متوجه اثر بازدارندگی از رشد این عصاره شدند، مطابقت دارد (8). باتوجه به پژوهشی که در سال 2001 با هدف بررسی فعالیت اثر سمیت سلولی دو عصاره هیدروالکلی و کلروفرمی D. mucronate بر روی هفت رده سلولی مختلف از جمله سرطان سینه، کارسینوم اپیتلویید دهانه رحم، لوسمی میلوژن، لوسمی مونوبلاستیک، میلوم موش و غیره انجام شده است نشان داده شد که عصاره هیدروالکلی D. mucronata فعالیت ضد توموری به ویژه در برابر رده‌های سلولی پستان و سرطان خون دارد (9). با توجه به اینکه در این تحقیق از روده سلولی A2870s استفاده شده است نمی توان این نتایج را نتایج قبلی قیاس مطلق نمود ولی می توان اثربخشی عصاره دافنه را در بازدارنگی رشد سلول های سرطانی که دارای ماهیت رشدی ( رشد خارج از کنترل) مشابه می باشند نشان داده و اثر کشندگی عصاره هیدرو الکلی D. mucronata را بر روی رده های سلولی دیگر مورد بررسی قرار داد. بنابراین با توجه به این پیش فرض، در این مطالعه اثر سیتوژنیک عصاره دافنه بر روی رده سلولی مورد بررسی قرار گرفت و نتایج مشابهی به‌دست آمد هر چند در میزان غلظت و زمان¬های تیمار تفاوت¬هایی وجود دارد ولی در اصل اثربخشی ماده خام این گیاه بر روی زنده مانی سلول‌های سرطانی مورد مطالعه به اثبات رسید. با توجه به نمودار زنده¬مانی سلول¬ها با استفاده از روش MTT تا غلظت 5 میکروگرم/میلی‌لیتر دارو تاثیر چندانی نداشته، ولی از محدوده غلظتی 200-5 میکروگرم/میلی‌لیتر کاهش چشم گیری در میزان سلول ها مشاهده می شود و بعد از غلظت 200 میکروگرم/میلی‌لیتر، تعداد سلول‌ها تقریبا به صفر می رسد و این نتایج نشان دهنده این است که عصاره خام دافنه بر زنده¬مانی سلول¬های A2780s اثر زیادی داشته و به نوعی وابسته به دز دارویی می باشد. روند کاهشی در بازه‌های زمانی 48 و 72 ساعت نسبت به 24 ساعت شیب بیشتری داشته است. بیشترین تاثیر دارو در محدوده غلظت 200-5 مشاهده شده و دوزهای IC50 به‌دست آمده در هر سه بازه زمانی نیز در این محدوده غلظت است.. بیشترین میزان کشندگی دارو در زمان¬های 48 و 72 ساعت است که می¬توان علت آن را زمان کافی برای تاثیر دارو دانست، البته نباید از دلایلی مثل افزایش مواد سمی ناشی از رشد سلول¬ها و نبودن فضای کافی به‌ویژه در زمان 72 ساعت، به راحتی عبور کرد. (14). یکی از فرضیه¬های این پایان¬نامه تاثیر عصاره خام دافنه بر مسیر ژن¬های PTK2 و MAPK8 بود که با تحقیقی که شانگ و همکارانش با عصاره گیاه D. giraldii روی رده سلولی سرطان کبد انجام دادند و مشاهده کردند که این ماده باعث توقف سلول در G0/G1 و کاهش سطح JNK فسفریله شده و از طریق مسیرهایJNK  و MAPK8 می¬شود و به‌طور انتخابی از تکثیر سلول¬های کبدی جلوگیری می¬کند مطابقت نداشت و هیچ تاثیر معناداری بر بیان ژن¬های PTK2 و MAPK8 نداشت (10). یکی از دلایل عدم تطبیق داده‌ها می‌تواند ناشی از نوع و واریته گیاه دافنه باشد که با توجه به متغیر بودن ترکیبات عصاره، اثرپذیری آن روی مسیرهای ژنی می تواند متفاوت باشد. نوع سلول مورد تیمار هم می¬تواند این اثرپذیری را تحت تاثیر قرار دهد. نحوه تهیه عصاره و خالص‌سازی آن نیز می تواند یکی از دلایل عدم این تاثیرپذیری باشد. استفاده از عصاره های خالص و یا مواد شیمیایی خالص‌سازی شده حتی فیتوهورمون های تولیدی در آزمایشگاه ها تحت عنوان ترکیبات آنالوگ مانند سورگولاکتون و استریگولاکتون ها می تواند اثرات مختلفی با آنچه در این مطالعه دیده شد بر روی مسیرهای ژنی داشته باشد. در یک مطالعه نشان داده شد که اثر GR24 بر روی بیان این ژن ها باعث افزایش میزان بیان ژن‌های مورد ارزیابی شده است (15).
نتیجه‌گیری
با توجه به نتایج حاصل در این تحقیق چنین نتیجه‌گیری می¬شود که گیاه دافنه توانسته است اثر مطلوب و معنی داری بر روی زنده مانی سلول ها داشته باشد که این نتایج می تواند در مطالعات تکمیلی امید بخش باشد. بازه های زمانی و میزان غلظت های دارو می تواند در اثر‌پذیری سلول ها و میزان مرگ و میر موثر باشد. بررسی بیان ژن¬ها نشان داد که عصاره خام گیاه دافنه اثر قابل ملاحظه¬ای را نسبت به تیمارهای شاهد بر روی بیان ژن های مورد آزمایش نشان نداده است. دلایل مختلفی نظیر دست‌ورزی، آغازگرهای مورد استفاده، نوع مواد داخل عصاره (اثر بازدارندگی واکنش زنجیره ای پلی مراز به وسیله بعضی از ترکیبات عصاره) و حتی نژاد و واریته گیاه در این فعالیت مولکولی تاثیرگذار بوده باشد. استفاده از سنتز نانوذرات به عنوان حامل عصاره برای هدف‌گذاری بیشتر سلول‌ها پیشنهاد می‌شود هر چند انجام آزمون گازکروماتوگرافی برای تعیین ساختار ترکیب عصاره در راستای مطالعات فارماکولوژی صنعتی و داروسازی توصیه می‌شود. همچنین استفاده از ژن‌های مختلف درگیر در سرطان برای تکمیل بخش مولکولی مطالعه پیشنهاد می‌شود.
سپاس‌گزاری
این مطالعه در قالب پایان‌نامه کارشناسی ارشد ژنتیک و با حمایت مالی حوزه معاونت مالی دانشگاه یزد انجام شد
حامی مالی: حوزه معاونت مالی دانشگاه یزد.
تعارض در منافع: وجود ندارد.
ملاحظات اخلاقی
پروپوزال این تحقیق توسط دانشگاه یزد تایید است (کد اخلاق  .(IR.YAZD.REC.1401/09/01
مشارکت نویسندگان
سید کاظم صباغ در ارائه ایده، مهتا مظاهری.در طراحی مطالعه،  فایزه بفرویی‌زاده و فرزانه شتابی در جمع‌آوری داده‌ها، محمد رضا سرافراز اردکانی در تجزیه و تحلیل داده‌ها مشارکت داشته و همه نویسندگان در تدوین، ویرایش اولیه و نهایی مقاله و پاسخگویی به سوالات مرتبط با مقاله سهیم هستند.
 

 

References:
 
1-    Matei D, Nephew KP. Epigenetic Attire in Ovarian Cancer: The Emperor's New Clothes. Cancer Res 2020; 80(18): 3775-85.
2-    Jayson GC, Kohn EC, Kitchener HC, Ledermann JA. Ovarian Cancer. The Lancet 2014; 384(9951): 1376-88.
3-    Wang S, Long S, Deng Z, Wu W. Positive Role of Chinese Herbal Medicine in Cancer Immune Regulation. The American Journal of Chinese Med 2020; 48(7): 1577-92.
4-    Mahato M, Patra S, Gogoi M. Herbal Nanocarriers for Cancer Therapy. Nanopharmaceuticals: Principles and Applications 2021; 2: 41-75.
5-    Aljelehawy Q, Karimi N, Alavi M. Comparison of Antibacterial and Cytotoxic Activities of Phytosynthesized Znonps by Leaves Extract of Daphne Mucronata at Different Salt Sources. Materials Technology 2021; 36(12): 747-59.
6-    Nazir N, Muhammad J, Ghaffar R, Nisar M, Zahoor M, Uddin F, et al. Phytochemical Profiling and Antioxidant Potential of Daphne Mucronata Royle and Action Against Paracetamol-Induced Hepatotoxicity and Nephrotoxicity in Rabbits. Saudi Journal of Biological Sciences 2021; 28(9): 5290-301.
7-    Fazal N, Khawaja H, Naseer N, Khan AJ, Latief N. Daphne Mucronata Enhances Cell Proliferation and Protects Human Adipose Stem Cells Against Monosodium Iodoacetate Induced Oxidative Stress in Vitro. Adipocyte 2020; 9(1): 495-508.
8-    Murat K, Marzia D, Lin L, Halmurat U. Antiproliferative Activity of Different Extracts from Daphne Altaica Pall. On Selected Cancer Cells. Journal of Medicinal Plants Research 2011; 5(15): 3448-52.
9-    AMIR GZ, Miri R, Javidnia K, Davoudi M. Study of Cytotoxic Activity of Daphne Mucronata Royle Grown in Iran. Iranian Journal of Medical Science 2001; 26(1): 146-51.
10-    Wang D, Sun Q, Wu J, Wang W, Yao G, Li T, et al. A New Prenylated Flavonoid Induces G0/G1 Arrest and Apoptosis Through P38/JNK MAPK Pathways in Human Hepatocellular Carcinoma Cells. Scientific Reports 2017; 7(1): 5736.
11-    Shang XY, Chen JJ, Song XY, Wang W, Chen Y, Yao GD, et al. Daphnegiravone D from Daphne Giraldii Nitsche Induces P38-Dependent Apoptosis Via Oxidative And Nitrosative Stress in Hepatocellular Carcinoma Cells. Biomedicine & Pharmacotherapy 2018; 107: 1426-33.
12-    Du WJ, Yang XL, Song ZJ, Wang JY, Zhang WJ, He X, et al. Antitumor Activity of Total Flavonoids From Daphne Genkwa in Colorectal Cancer. Phytother Res 2016; 30(2): 323-30.
13-    Yu J, Chen Q. The Plant Extract of Pao Pereira Potentiates Carboplatin Effects Against Ovarian Cancer. Pharmaceutical Biology 2014; 52(1): 36-43.
14-    Li J, Jiang K, Zhao F. Icariin Regulates the Proliferation and Apoptosis of Human Ovarian Cancer Cells through Microrna-21 by Targeting Pten, Reck and Bcl-2. Oncol Rep 2015; 33(6): 2829-36.
15-    Shetabi F. The Effect of Gr24 on Cell Viability an Expression of Mir155 and Mapkinase14 in A2780s Cancer Cell Line:Yazd University; 2022.