ماهنامه علمی پ‍ژوهشی

مقدمه
باکتریوسین‎ها، پپتید‌هایی با فعالیت ضد میکروبی مشخص و غلظت‎های معین هستند. آن‎ها به‌صورت ریبوزومال سنتز شده و توسط طیف وسیعی از باکتری‎ها تولید می‎شوند (1). این مولکول‎ها برای نخستین بار توسط آندره گراتیا در سال 1925 در باکتری (E. coli) Escherichia coli شناسایی شدند (2). بیشتر باکتریوسین‎ها در برابر باکتری هدف خود نسبت به آنتی‎بیوتیک‎ها در غلظت‎های پایین‎تری مؤثر هستند (3). کلیسین‎ها گروهی از باکتریوسین‎ها هستند که توسط بیش از نیمی از سویه‎های E. coli تولید می‎شوند (4). آن‎ها با ایجاد منفذ در غشای داخلی باکتری‎ها، مهار سنتز پپتیدوگلیکان دیواره سلولی و تجزیه DNA و RNA داخل سلولی، سویه‎هایE. coli غیر میزبان را از بین می‎برند (5). کلیسین‎ها در باکتری‎های کومنسال که فاقد فاکتورهای ویرولانس، ادهزین (Adhesion) و توکسین هستند، مانع از رشد باکتری‎های پاتوژن می‎شوند و در سویه‎های پاتوژن باعث افزایش بیماری‌زایی باکتری می‎گردند (6). در E. coli، تولید چندین باکتریوسین توسط یک سویه، پدیده‎ای رایج است. از جمله کلیسین‎های Ia و V که هر دو بر روی پلاسمیدهایی با وزن مولکولی بالا و اندازه‎هایی متفاوت کدگذاری می‎شوند (7). کلیسین‎ Ia یک پروتئین kd70 است که در شرایط استرس (تحت تنظیم سیستم SOS) القا می‎شود و موجب توقف نشر ماکرومولکول‎ها و ممانعت از تولیدATP می‎گردد (8,9). کلیسین V بسیار کوچک‌تر است (کمتر از kd10) و تولید آن تحت شرایط محدودیت آهن القا می‎گردد (10). دو نوع فاکتور ویرولانس روی کلیسین V قرار دارد.iss  که مقاومت به سیستم کمپلمان را افزایش می‎دهد و ii که جذب آهن توسط باکتری را تسهیل می‎کند (11,12). ژن کد کننده کلیسین Ia در اغلب سویه‎های واجد ژن کلیسینV گزارش شده است که علت آن، ادغام اپرون کلیسین V در پلاسمید کد کننده کلیسین Ia می‎باشد (13). با توجه به نقش کلیسین‎ها در افزایش بیماری‌زایی باکتری‎های پاتوژن و پتانسیل بالقوه استفاده از این ترکیبات در بیوتکنولوژی، هم‌چنین عدم بررسی الگوی فراوانی انواع کلیسین‎ها در نمونه‎های بالینی در ایران، هدف از این مطالعه، تعیین فراوانی ژن‌های تولیدکننده کلیسین‎های Ia و V در ایزوله‎های Esherichia coli جدا شده از نمونه ادرار بیماران مبتلا به عفونت ادراری در مراکز درمانی شهر یزد می‌باشد.
روش بررسی
نمونه‎گیری، جداسازی و تعیین هویت E. coli: در این مطالعه توصیفی - مقطعی در یک بازه زمانی سه ماهه (از آبان ماه تا بهمن ماه 1396) تعداد 160 جدایه باسیل گرم منفی مشکوک به E. coli جدا شده از ادرار بیماران مبتلا به عفونت‌ ادراری مراجعه‌کننده به آزمایشگاه مراکز درمانی شهر یزد به همراه اطلاعات دموگرافیک جمع‌آوری شد. نمونه‌‎ها بر روی محیط EMB (ائوزین- متیلن بلو) کشت داده شده و پس از گرم‌خانه‎گذاری به مدت 24 تا 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‎گراد، با استفاده از رنگ‌آمیزی گرم و محیط‌های افتراقی TSI(Triple Sugar Iron)، اوره، SIM (Sulfide-Indol-Motility)، سیمون سیترات و MR-VP ( Methyl Red and Voges-Proskauer)، تعیین هویت شدند. تمامی جدایه‎ها برای مطالعات بیشتر در محیط کشت مایعTSB (Tryptic soy broth) با گلیسرول 15 درصد در دمای منفی 70 درجه سانتی‎گراد نگهداری شدند. تمامی محیط‌های کشت ساخت شرکت Merck Darmstadt کشور آلمان بودند.
ارزیابی ژن‎های مورد بررسی: استخراج DNA ژنومی جدایه‎ها به روش Boiling صورت گرفت (14). جهت تکثیر ژن‎های col V و col Ia از پرایمر‎های اختصاصی استفاده گردید که در جدول 1 آمده است. سپس واکنش زنجیره پلیمراز (PCR) در حجم μL 20 شامل μL2 DNA الگو، μL1 از هر پرایمر Forward و Reverse(پیشگام، ایران)، μL 10 از master mix 2x (آمپلیکون، دانمارک) و μL 6 آب مقطر تزریقی استریل انجام شد.
برنامه حرارتی دستگاه ترموسایکلر (Quanta biotech S96) به صورت ذیل انجام گرفت:
در مورد ژن col V: واسرشت‌ اولیه در دمای 95 درجه سانتی‎گراد به مدت 12 دقیقه، 25 سیکل حرارتی واسرشت‎ در دمای 94 درجه سانتی‎گراد به مدت 30 ثانیه، اتصال پرایمر در 63 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه و گسترش در 68 درجه ‎سانتی‌گراد به مدت 3 دقیقه بود. سپس یک مرحله گسترش نهایی به مدت 10 دقیقه در 72 درجه‎ سانتی‌گراد صورت گرفت. در مورد ژن col Ia: واسرشت‎ اولیه در دمای 94 درجه ‎سانتی‌گراد به مدت 2 دقیقه، 30 سیکل حرارتی واسرشت‎ در دمای 94 درجه‎ سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه، اتصال پرایمر در 54 درجه ‎سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه و گسترش در 72 درجه ‎سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه بود. سپس یک مرحله گسترش نهایی به مدت 7 دقیقه در 72 درجه‎ سانتی‌گراد صورت گرفت. محصول PCR بر روی ژل آگارز 2/1 درصد، الکتروفورز و در کنارbp DNA Ladder 50 با استفاده از DNA Green Viewer بررسی شد. از هر یک از ژن‎های تکثیر شده، یک نمونه جهت تعیین توالی ارسال گردید و نتایج با استفاده از نرم‎افزار آنلاین (Blast NCBI 104) مورد بررسی قرار گرفت.


تجزیه و تحلیل آماری
داده‎ها توسط نرم‎افزارSPSS version 16  ((IBM corporation Armonk.NY و آزمون Chi-Square مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.
نتایج
در این مطالعه فراوانی ژن‎‎های تولید کننده‌ col V و col Ia در 160 جدایه E. coli به‌دست آمده از نمونه‎های ادراری بیماران مبتلا به عفونت ادراری، با استفاده از تکنیک PCR بررسی گردید. از این تعداد جدایه در 43 مورد (26/9 درصد)، ژن کلیسین شناسایی شد به‌طوری که ژن col Ia در 39 مورد (24/4 درصد) و ژن col V در 17 مورد (10/6 درصد) از جدایه‎ها یافت شد؛ همچنین در 13 مورد (8/12 درصد) از جدایه‎ها، هر دو ژن مورد بررسی با هم شناسایی گردید. جدول 2 توزیع فراوانی ژن‎های col V و col Ia را نشان می‎دهد.
 

جدول1: پرایمرهای مورد استفاده


 

col V،col Iaجدول2: فراوانی





تصویر1: بررسی محصول ژن col V  و col Ia.  ستون اول bpDNA ladder50. شماره‌های 1 تا 5 ایزوله‌های دارای ژن col V. شماره 6 ایزوله فاقد ژن . col V شماره‌های 7 تا 11 ایزوله‌های دارای ژن col Ia
 
بحث
امروزه باکتریوسین‎ها به عنوان جایگزین‎های بالقوه برای آنتی‎بیوتیک‎های سنتی، نگهدارنده‎های طبیعی مواد غذایی و ترکیباتی جذاب در صنایع دارویی جهت پیشگیری از رشد باکتری‎های بیماری‎زا، مورد توجه قرار گرفته‎اند (18-15). به علاوه این ترکیبات، تعدیل کننده‎های مهم میکروبیوتای روده نیز در نظر گرفته می‎شوند (19). تولید همزمان چندین باکتریوسین به وسیلهِ‌ی یک سویه، مزیتی انتخابی به‌شمار می‎رود؛ زیرا به دلیل به‌کارگیری گیرنده‎های سطحی مختلف، مقاومت نسبت به سویه‎های تولیدکننده آن‎ها کمتر رخ می‎دهد. خصوصیات ژنوتیپی سویه‎های E. coli نشان می‎دهد که ژن‎های تولید کننده‌ی col V و col Ia در یک سویه، بر روی یک پلاسمید مزدوج کدگذاری می‌شوند. لذا بیشتر از آنچه که به‌طور تصادفی انتظار می‎رود با هم ارتباط دارند (20). در مطالعه حاضر از 160 جدایه E. coli مورد بررسی، 17جدایه (10/6 درصد) دارای ژن col V بودند که از این تعداد، 4 جدایه (2/5درصد)، تنها ژن col V را داشتند. هم‌چنین 39 جدایه (24/4 درصد) دارای ژن col Ia بودند که از این تعداد، در26 جدایه (16/25 درصد) تنها ژن col Ia یافت شد. در این میان 13 جدایه (8/12 درصد) دارای هر دو ژن col V و col Ia بودند. الگوی فراوانی باکتریوسین‎ها در باکتری‎ها به عوامل مختلفی مانند نوع نمونه، رژیم غذائی، کیفیت زیستگاه، ویژگی‎های میزبان و منطقه جغرافیایی بستگی دارد (21). در مطالعه‎ای که توسط تقوی و همکاران در سال 2014 بر روی 120 نمونه E. coli کومنسال جدا شده از مدفوع کودکان مراجعه کننده به مراکز درمانی شهر یاسوج انجام گرفت؛ نشان داده شد که 70/8 درصد از سویه‎ها دارای ژن کلیسین بودند. فراوانی ژن col V (5/22 درصد) و فراوانی ژن col Ia (5/27 درصد) گزارش شد. همچنین فراوانی باکتری‌هایی که هر دو ژن را داشتند برابر با 15/4 درصد بود (14). نتایج این مطالعه با یافته‎های مطالعه حاضر همخوانی نداشت که علت آن را می‎توان به تفاوت در نمونه مورد بررسی نسبت داد. در بررسی Smaj و همکاران که در سال 2010 در جمهوری چک انجام شد، تعداد 361 نمونه E. coli از عفونت ادراری و 411 نمونه مدفوع بدون عفونت گوارشی به عنوان سویه کنترل بررسی شد. در این مطالعه، 54 درصد از جدایه‎های عفونت ادراری و 55 درصد از جدایه‎های مدفوع، دارای ژن کلیسین بودند. 2/6 درصد از سویه‎های جدا شده از عفونت ادراری فقط دارای ژن col V بودند، 4/1 درصد از سویه‎ها فقط ژن col Ia را داشتند و 12/8 دارای هر دو ژن col V و col Ia بودند. از نظر آماری تفاوت معنی‎داری در تولید باکتریوسین در سویه‎های عامل عفونت ادراری و سویه‎های کنترل یافت نشد. این بررسی ممکن است بیانگر این واقعیت باشد که اکثر سویه‎های عامل عفونت ادراری از روده انسان منشاء می‎گیرند (22). نتایج به‌دست آمده از سویه‎های عامل عفونت ادراری در مورد کلیسین V و سویه‎هایی که هر دو نوع کلیسین را داشتند با مطالعه ما همخوانی داشته ولی در مورد سویه‎هایی که فقط کلیسینIa را داشتند، کمتر از مطالعه ما بود. در بررسی Kylie و همکاران که در سال 2004 در آمریکا انجام شد، تعداد 200 جدایه E. coli به‌دست آمده از عفونت ادراری بررسی شد؛ 7/5 درصد از سویه‎های عامل عفونت ادراری دارای ژن col V بودند که با مطالعه ما همخوانی داشت (23). در بررسی Zhao و همکاران که در سال 2009 در چین انجام شد، 100 جدایه E. coli پاتوژن پرندگان با 202 جدایه عفونت ادراری از نظر فاکتورهای ویرولانس مقایسه شدند که 53 درصد از سویه‎های پاتوژن پرندگان و 13 درصد از سویه‎های عفونت ادراری دارای کلیسین V بودند (24)، که با مطالعه ما همخوانی داشت. کلیسین V به عنوان یک فاکتور ویرولانس به ویژه در سویه‎های عامل عفونت پرندگان، شناخته شده است (25). در مطالعه Micencova و همکاران که بر روی 1181 ایزوله E. coli جدا شده در طی سال‎های 2007 تا 2010 در جمهوری چک انجام شد، 399 سویه غیر پاتوژن، 179 سویه مرتبط با اسهال و 603 سویه پاتوژن روده‎ای از نظر وجود 17 عامل ویرولانس و 31 باکتریوسین مورد بررسی قرار گرفت. فراوانی کلیسین V در سویه‎های غیر پاتوژن 4/5 درصد، در سویه‎های مرتبط با اسهال 10/1 درصد و در سویه‎های پاتوژن خارج روده‎ای 25/2 درصد بود. هم‌چنین فراوانی ژن col Ia در سویه‎های غیر‎پاتوژن، سویه‎‎های مرتبط با اسهال و سویه‎های پاتوژن خارج روده‎ای به ترتیب 13/3، 12/8 و 20/7 درصد بود (13). نتایج به دست آمده نشان داد، فراوانی ژن‎های کد کننده باکتریوسین در E. coli کاملا مرتبط با فراوانی عوامل ویرولانس است و سویه‎های عامل عفونت‎های خارج روده‎ای که فاکتورهای ویرولانس را کد می‎کنند، اغلب ژن‎های تولیدکننده کلیسین و میکروسین را نیز کد می‎کنند (13).
نتیجه‌گیری
مطالعه حاضر، اولین مطالعه انجام شده پیرامون فراوانی ژن‌های col V و col Ia در ایزوله‌های E. coli جدا شده از عفونت ادراری در استان یزد می‌باشد. این ترکیبات دارای فعالیت ضد میکروبی در برابر باکتری‌های بیماری‌زا هستند که پتانسل استفاده از آن‌ها در بیوتکنولوژی را توجیه می‌کند. نتایج به‌دست آمده از این مطالعه در بیشتر موارد، مطابق با مطالعات قبلی و در مواردی نیز تفاوت داشت که این تفاوت می تواند ناشی از تفاوت در رژیم غذایی، ویژگی میزبان و ویژگی جغرافیایی باشد. کلیسین V در شرایط کمبود آهن و کلیسین Ia در شرایط کمبود عمومی مواد غذایی القا می شود. ژن کد کننده کلـیسـین Ia دراغلب سویه‌های واجد ژن کلـیسـین V گـزارش شـده است. در بررسی ما نیز مشاهده گردید که کلیسین V معمولاً همراه با کلیسین Ia وجود دارد وکمتر به تنهایی مشاهده می‌شود. از طرف دیگر کلیسین Ia شیوع بالاتری داشته و حضور آن بدون همراهی کلیسین V معمول است.
سپاس‌گزاری
این مقاله حاصل پایان‌نامه دانشجویی مقطع کارشناسی ارشد است.
حامی مالی: دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد
تعارض در منافع: وجود ندارد.
کد اخلاق و ملاحظات اخلاقی
پروپوزال این تحقیق توسط دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد، تایید شده است (کد اخلاقIR.SSU.MEDICINE.REC.1396.167).

 

References:
 
1-    Chikindas ML, Weeks R, Drider D, Chistyakov VA, Dicks LM. Functions and Emerging Applications of Bacteriocins. Curr Opin Biotechnol 2018; 49: 23-8.
2-    Gratia A. Sur un Remarquable Exemple D'antagonisme Entre Deux Souches De Coilbacille. C R Seances Soc Biol Fil 1925; 93: 1040-1.
3-    Güllüce M, Karadayı M, Bariş Ö. Bacteriocins: Promising Natural Antimicrobials. Local Environ 2013; 3(6).
4-    Cascales E, Buchanan SK, Duché D, Kleanthous C, Lloubès R, Postle K, et al. Colicin Biology. Microbiology and Molecular Biology Reviews 2007; 71(1): 158-229.
5-    Pipercevic J, Jakob RP, Righetto RD, Goldie KN, Stahlberg H, Maier T, et al. Identification of a Dps Contamination in Mitomycin-C-Induced Expression of Colicin Ia. Biochim Biophys Acta Biomembr 2021; 1863(7): 183607.
6-    O'Brien VP, Hannan TJ, Nielsen HV, Hultgren SJ. Drug and Vaccine Development for the Treatment and Prevention of Urinary Tract Infections. Microbiol Spectr 2016; 4(1): 10.
7-    Gordon DM, O'Brien CL. Bacteriocin Diversity and the Frequency of Multiple Bacteriocin Production in Escherichia Coli. Microbiology (Reading) 2006; 152(Pt11): 3239-44.
8-    Karpiński TM, Szkaradkiewicz AK. Characteristic of Bacteriocines and Their Application. Pol J Microbiol 2013; 62(3): 223-35.
9-    Murray P, Rosenthal K, Pfaller M. Medical Microbiology. Elsevier Health Sciences 2015.
10-    Dobrindt U, Hacker J. Uropathogens and Virulence Factors. Urogenital Infections 2010: 4-22.
11-    Gao Q, Wang X, Xu H, Xu Y, Ling J, Zhang D, et al. Roles of Iron Acquisition Systems in Virulence of Extraintestinal Pathogenic Escherichia Coli: Salmochelin and Aerobactin Contribute More to Virulence Than Heme in a Chicken Infection Model. BMC Microbiol 2012; 12(1): 143.
12-    Subashchandrabose S, Mobley HLT. Virulence and Fitness Determinants of Uropathogenic Escherichia Coli. Microbiol Spectr 2015; 3(4): 10.
13-    Micenková L, Štaudová B, Bosák J, Mikalová L, Littnerová S, Vrba M, et al. Bacteriocin-Encoding Genes and Expec Virulence Determinants are Associated in Human Fecal Escherichia Coli Strains. BMC Microbiol 2014; 14(1): 109.
14-    Taghavi S, Kargar M, Doosti A. Molecular Identification of the Colicin Types in Escherichia Coli in the Yasuj City. Armaghane Danesh 2014; 19(4): 371-9. [Persian]
15-    Chumchalová J, Šmarda J. Human Tumor Cells Are Selectively Inhibited By Colicins. Folia Microbiol (Praha) 2003; 48(1): 111-5.
16-    Jin X, Kightlinger W, Kwon YC, Hong SH. Rapid Production and Characterization of Antimicrobial Colicins using Escherichia Coli-Based Cell-Free Protein Synthesis. Synth Biol (Oxf) 2018; 3(1): Ysy004.
17-    Kaur S, Kaur S. Bacteriocins as Potential Anticancer Agents. Front Pharmacol 2015; 6: 272.
18-    Schillinger U, Geisen R, Holzapfel WH. Potential of Antagonistic Microorganisms and Bacteriocins for the Biological Preservation of Foods. Trends In Food Science & Technology 1996; 7(5): 158-64.
19-    Angelakis E, Merhej V, Raoult D. Related Actions of Probiotics and Antibiotics on Gut Microbiota and Weight Modification. Lancet Infect Dis 2013; 13(10): 889-99.
20-    Jeziorowski A, Gordon DM. Evolution of Microcin V and Colicin Ia Plasmids in Escherichia Coli. J Bacteriol 2007; 189(19): 7045-52.
21-    Barnes B, Sidhu H, Gordon DM. Host Gastro-Intestinal Dynamics and the Frequency of Colicin Production by Escherichia Coli. Microbiology (Reading) 2007; 153(Pt 9): 2823-7.
22-    Smajs D, Micenková L, Smarda J, Vrba M, Sevčíková A, Vališová Z, et al. Bacteriocin Synthesis in Uropathogenic and Commensal Escherichia Coli: Colicin E1 is A Potential Virulence Facto.  BMC Microbiol 2010; 10: 288.
23-    Rodriguez-Siek KE, Giddings CW, Doetkott C, Johnson TJ, Fakhr MK, Nolan LK. Comparison of Escherichia Coli Isolates Implicated in Human Urinary Tract Infection and Avian Colibacillosis. Microbiology (Reading) 2005; 151(Pt 6): 2097-110.  
24-    Zhao L, Gao S, Huan H, Xu X, Zhu X, Yang W, et al. Comparison of Virulence Factors and Expression of Specific Genes between Uropathogenic Escherichia Coli and Avian Pathogenic E. Coli in a Murine Urinary Tract Infection Model and a Chicken Challenge Model. Microbiology (Reading) 2009; 155(Pt 5): 1634-44.
25-    Johnson TJ, Siek KE, Johnson SJ, Nolan LK. Dna Sequence of a Colv Plasmid and Prevalence of Selected Plasmid-Encoded Virulence Genes among Avian Escherichia Coli Strains. J Bacteriol 2006; 188(2): 745-58.