ماهنامه علمی پ‍ژوهشی

مقدمه
تومورها و کیست‌های ادنتوژنیک بخش مهمی از آسیب‌شناسی دهان و فک و صورت را به خود اختصاص می‌دهند. کیست دنتی ژروس شایع‌ترین کیست تکاملی ادنتوژنیک می‌باشد که به‌ احتمال زیاد در اثر تجمع مایع بین اپی‌تلیوم کاهش‌یافته مینایی و تاج دندان به وجود می‌آید. مکانیسم رشدی این کیست؛ مانند سایرکیست‌ها است و احتمال تغییرات نئوپلاستیک به آملوبلاستوما و به‌ندرت کارسینوم سلول سنگ‌فرشی و موکواپی درموئید کارسینوما وجود دارد (1). ادنتوژنیک کراتوسیست (OKC )11/2 درصد از تمام کیست های تکاملی را به خود اختصاص می دهد و از بقایای تیغه دندانی به وجود می آید (3، 2) .پاتوژنز این کیست به خوبی شناخته نشده است و مکانیسم رشدی و رفتار بیولوژیکی متفاوتی نسبت به سایر تومورهای ادنتوژنیک نشان می دهد که شاید بتوان علت آن را فاکتورهای ناشناخته ذاتی دراپی‌تلیوم یا فعالیت آنزیماتیک دردیواره فیبروزه کیست دانست (4). ازجمله مکانیسم‌های رشدی OKC میزان تکثیر بالا و بیان بالای پروتئین‌های ضدآپوپتوز (Bcl2) و متالوپروتئازها)  MMP2ˌ9 ( می‌باشد (6،‌5). پیشروی منظم سلول‌ها در چرخه سلولی توسط کینازهای وابسته به سیکلین پس از اتصال این کینازها به خانواده دیگری از پروتئین‌ها موسوم به سیکلین، سازماندهی می‌شود. پروتئین‌هایی که درتنظیم چرخه سلولی نقش دارند شامل انکوژن‌ها و ژن‌های سرکوب‌گر تومور می‌باشند (4). P53 یکی از ژن‌های سرکوب‌گر تومور می باشد که درتنظیم مسیرهای ترمیم DNA، آپوپتوز، آنژیوژنز و حفظ ثبات ژنومی نقش دارد. P53 به‌صورت منفی به وسیله تقابل با انکوپروتئینHuman homologue of murine double muinute 2 ( MDM2) تنظیم می‌گردد (7،‌4). تقویت MDM2 در بسیاری از بدخیمی‌های انسانی از جمله سرطان ریه، روده بزرگ و سایر بدخیمی‌ها شناسایی شده است. بیان بالای این پروتئین در مقاومت شیمی‌درمانی سرطان‌های انسانی از طریق ارتباط متقابلMDM2-P53  حاصل می‌شود (8). MDM2 که به عنوان یک انکوژن شناخته می‌شود دارای دو عامل فعال‌کننده رونویسی به نام P1 و P2 می‌باشد که P2 وابسته به P53 است. در حالت نرمال MDM2 در هسته تولید می‌شود ولی جهت تنظیم منفی عوامل هدف خود (P53) به‌وسیله پروتئازوم‌ها به سیتوپلاسم منتقل می‌شود (10، 9، 4). مطالعات مختلفی جهت بررسی بیان MDM2 درضایعات مختلف انجام شده است اما بررسی‌های اندکی درکیست‌های ادنتوژنیک صورت گرفته است (9). از طرفی نتایج متناقصی بین مطالعات مختلف درباره بیان MDM2 درکیست های ادنتوژنیک وجود دارد (12، 11، 7، 4). لذا با توجه به نتایج متناقص و مطالعات اندکی که دراین زمینه صورت گرفته است، هدف این مطالعه بررسی بیان نشانگر MDM2 به عنوان یک شاخص مهم تکثیر و تنظیم چرخه سلولی در OKC وکیست دنتی‌ژروس می‌باشد.
روش بررسی
این مطالعه توصیفی - مقطعی در سال 1398 در بخش آسیب‌شناسی بیمارستان شهید صدوقی یزد انجام شد. پس ازبررسی پرونده‌های بیماران مراجعه‌کننده به بخش آسیب‌شناسی از بین کلیه کیست‌ها به روش سرشماری و با توجه سطح معنی‌داری 5 درصد و توان آزمون 80 درصد و با توجه به مقدار انحراف معیار نمره رنگ‌پذیری= 6 واختلاف معنی‌دار حداقل 7 نمره در گروه‌ها، تعداد 15 بلوک از هر یک از کیست‌های دنتی‌ژروس وOKC  (نمونه‌هایی با پرونده‌های کامل و بلوک‌هایی حاوی بافت کافی وارد مطالعه شده وokc های سندرومیک و عود کننده خارج شدند.) در خواست و پس از ثبت اطلاعات بالینی، مراحل ایمونوهیستوشیمی انجام شد. پس از تهیه مقاطع 4 میکرومتری، مراحل پارافین‌زدایی، آبگیری و غوطه‌ور سازی داخل بافر (TRIs BUFFERED SALIN) TBS) (DAKO-DENMARK)  با7/4 :ph به مدت 10 دقیقه انجام گرفت. سپس به منظور جلوگیری از رنگ‌پذیری غیراختصاصی ازبلوکرH202) (DAKO- DENMARK)، به میزان 1 سی‌سی در 9 سی‌سی اتانول به مدت 20 دقیقه استفاده شد. پس ازشستشو در آب و استفاده از بافر بازیافت (DAKO-DENMARK) با9 PH: مقاطع داخل مایکروویو با حداکثر توان جوش گذاشته شد .پس از سرد شدن، آنتی‌بادی علیه) MDM2 آمریکا (abcam-اضافه شد و مجدداً داخل بافر TBS غوطه‌ور گردید .سپس به مدت 30 دقیقه از HRP (HORSE RADISH OROXIDOSE) (DAKO-DENMARK) استفاده و پس از2 مرحله شستشو با TBS و آب با هماتوکسیلین رنگ‌آمیزی شده و پس از شستشو با آب داخل گزیلل و الکل غوطه‌ور گردید. اسلایدهای آماده‌سازی شده زیرمیکروسکوپ نوری توسط دو نفر پاتولوژیست با بزرگنمایی 400 x مشاهده و درصد سلول‌های رنگ گرفته در لایه‌های بازال و سوپرابازال بر طبق فرمول زیر  ( Labeling index  ) محاسبه گردید (7).
100×تعداد هسته‌های رنگ گرفته
تعداد1000عدد هسته سلول در10 فیلد تصادفی
بر اساس درصد مشخص شده، اسکور بروز MDM2 به صورت زیر مشخص گردید. کمتر از 5 درصد : اسکور 0 (منفی)، 6 تا 25 درصد اسکور 1 (ضعیف)، 26 تا 50 درصد اسکور 2 (متوسط) و بالای 51 درصد اسکور 3 (شدید).
تجزیه و تحلیل آماری
در نهایت داده‌ها وارد نرم‌افزارversion 16  SPSS شده و با استفاده ازآزمون آماری t-test آنالیز گردید.
نتایج
مطالعه حاضر به منظور بررسی میزان بروز MDM2 بر روی 15 نمونه OKC و15نمونه کیست دنتی‌ژروس با استفاده از روش ایمونوهیستوشیمیایی صورت گرفت و میزان بروز MDM2 در هریک از نمونه‌ها زیر میکروسکوپ مشاهده و اسکور هر اسلاید محاسبه شد )تصویر 1).
 



تصویر 1: سلول‌های بیان کنندهMDM2 به رنگ قهوه‌ای در لایه‌های بازال و سوپرابازال
الف) OKC و ب) کیست دنتی‌ژروس ( 400x )




نمودار 1: فراوانی کیست دنتی‌ژروس بر اساس متغیرهای زمینه‌ای



نمودار2: فراوانی OKC بر اساس متغیرهای زمینه‌ای
در نمودار 1 و 2 فراوانی هر یک از کیست‌ها براساس متغیرهای زمینه‌ای آمده است.
جدول 1: تعیین و مقایسه بروز MDM2 در دولایه بازال وسوپرابازال بین OKC  وکیست دنتی‌ژروس



OKC: Odontogenic keratocyst        DC:Dentigerous cyst
نتایج آزمون‌های آماری نشان داد که اگرچه در هر دو ناحیه بازال و سوپرا بازال بروز MDM2 در OKC  بالاتر از کیست دنتی‌ژروس بود اما رابطه معنی‌داری دیده نشد

جدول 2: تعیین و مقایسه بروز MDM2 بین دو ناحیه مورد بررسی در OKC و کیست دنتی ژروس



مقایسه بیان MDM2  بین نواحی مورد بررسی در هر دو گروه نشان دهنده بروز بالاتر و معنی‌دار MDM2 در ناحیه سوپرابازال نسبت به ناحیه بازال بود
MDM2  در هر دو گروه در سنین بالای 30 سال و خانم‌ها بروز بالاتری داشت اما از نظر آماری معنی‌دار نبود

جدول 3: تعیین و مقایسه بروز MDM2در OKCو کیست دنتی‌ژروس بر اساس سن


   
مقایسه بروز MDM2 بر اساس محل کیست‌ها نتایج آماری معنی‌داری را نشان نداد.

جدول 4: تعیین و مقایسه بروزMDM2  در OKC ودنتی‌ژروس براساس جنس



       مقایسه بروز MDM2 بر اساس محل کیست‌ها نتایج آماری معنی‌داری را نشان نداد.
 
بحث
مقایسه نتایح این مطالعه با مطالعات گذشته نشان داد که مطالعه ما با تعدادی از مطالعات مشابه و با تعدادی در تناقض می‌باشد. در مطالعه شجاعی همچون مطالعه ما بروزMDM2 در OKC بالاتر از دنتی‌ژروس بود و سلول‌های لایه سوپرا بازال نسبت به لایه بازال بروز بالاتری را نشان دادند (4). در مطالعه شریفی سیستانی 80% OKCهای مورد مطالعه MDM2 را بیان کردند (7) در حالی‌که در مطالعه  Galvaoهیچ یک از کیست‌های ادنتوژنیک مورد مطالعه مارکرMDM2  را بروز ندادند (10). در مطالعه ما همچون مطالعه‌Carvalhais ،MDM2  در تمامی نمونه‌های OKC مثبت شد و میزان بروز آن در این دسته ازکیست‌ها نسبت به سایر کیست‌ها و تومورهای ادنتوژنیک بالاتر بود (13). در مطالعه شجاعی شدت رنگ‌پذیری در هردو گروه مورد بررسی شدید بود در حالی‌که در مطالعه ما شدت رنگ‌پذیری در OKC ضعیف تا متوسط و در دنتی‌ژروس منفی یا ضعیف بود (4). در مطالعه ساغروانیان همچون مطالعه ما شدت رنگ‌پذیری در دنتی ژروس ضعیف بود اما بر خلاف مطالعه ما میزان بروز  MDM2در لایه بازال بیشتر از لایه‌های دیگر اپیتلیوم بود. البته دراین مطالعه مقایسه‌ای بین لایه‌های اپیتلیالی کیست‌های مختلف انجام نشد در حالی‌که در مطالعه ما این مقایسه صورت گرفت (14). در اکثر تحقیقات صورت گرفته، مارکرهای تکثیرسلولی در کیست دنتی‌ژروس نسبت به سایر کیست‌های ادنتوژنیک (رادیکولار و OKC) بروز کمتری را ازخود نشان داده‌اند (16-14). شاید دلیل نتایج متناقض‌، نوع آنتی‌بادی مصرفی‌، دسترسی به آنتی بادی‌، تفاوت در مراحل آماده‌سازی بافت نظیر روش فیکس‌کردن‌، روش بازیافت آنتی ژن و ... باشد (20-4،17)‌. در اغلب مطالعات انجام گرفته در زمینه بررسی تظاهر P53 و MDM2 در کیست ها و تومورهای ادنتوژنیک‌، سلول‌های سوپرابازال درOKC  نسبت به سلول‌های بازال رنگ‌پذیری بیشتر و شدیدتری داشتند (2،4،7،23-17). مطالعات هیستوشیمی وهیستولوژی نشان داده‌اند که درOKC  سلول‌های لایه بازال نسبت به سلول‌های سوپرابازال تمایز یافته‌تر هستند. از طرفی سلول‌های سوپرابازال در مرحله‌ای از چرخه سلولی قرار دارند که تظاهر بالاتری را نشان می‌دهند چرا که سلول‌های لایه بازال اغلب به شکل سلول‌های بنیادی با چرخه سلولی آهسته و فاز G1 طولانی می‌باشند (4). افزایش تکثیر سلولی احتمالاً در شکل‌گیری و رشد کیست‌ها و تومور‌های ادنتوژنیک نقش دارد. موتاسیون ژن P53  می‌تواند به عنوان یکی از عوامل افزایش تکثیر سلولی باشد (19). بروز بالای P53 موتاسیون یافته و به دنبال آن  MDM2در پوشش اپیتلیالی کیست‌های ادنتوژنیک به خصوص ،OKC به معنای فعالیت تکثیری بالای این اپیتلیوم می‌باشد که ممکن است نشان‌دهنده عود بالا یا رفتار نئوپلاستیک OKCباشد (11،24). در مطالعه Chetana بیان بالاتر MDM2 درOKC های عودکننده نشان‌دهنده نقش این تنظیم‌کننده‌های بالادستی p53 در رفتار تهاجمی ضایعه می‌باشد. در این مطالعه بیان همزمان P53 و MDM2 در نمونه‌های عود‌کننده مشاهده شد که می‌تواند بیانگر این احتمال باشد که به دنبال بیان نابجای اولیه P53، حلقه بازخورد MDM2 برای تخریب پروتئازوم p53 فعال می‌شود. با وجود فعال‌شدن MDM2، تخریب p53 به‌طور کامل صورت نمی‌گیرد. یکی از توضیحات این استدلال این است که MDM2 دارای دو عملکرد ظاهراً متضاد است، یک عملکرد تومورزایی و یک عملکرد توقف رشد. این نقش دوگانه MDM2 می‌تواند به سطح MDM2 بیان شده در سلول و هم‌چنین تعادل تنظیم‌کننده‌های مثبت و منفی چرخه سلولی بستگی داشته باشد که برای کنترل تکثیر سلولی حیاتی است (23). از طرفی محرک اصلی رشد وشکل‌گیری در کیست دنتی ژروس کاملاً مشخص نیست اما اغلب یک التهاب خفیف در این کیست مشاهده می‌شود که می‌تواند سبب القای تکثیر اپی‌تلیالی شود. اما این التهاب غیر مداوم بوده و تنها در زمان‌های اندکی رخ می‌دهد. این مسئله احتمالاً می‌تواند منجر به بروز ضعیف‌تر وکمتر P53 و MDM2 در این کیست گردد. همانند کیست‌های دیگر بزرگ‌شدن این کیست می‌تواند ناشی از تکثیرسلولی‌، فاکتورهای تحلیل برنده استخوان و یا افزایش فشار اسمزی مایع داخل کیست باشد. احتمال تبدیل شدن این کیست به تومورهایی مثل آملوبلاستوما وبه احتمال کمتر کارسینوم سلول سنگ‌فرشی و MECحاکی از قدرت تکثیر بالای لایه‌های سوپرابازال این کیست باشد که در مطالعه ما هم به این نکته اشاره شده است (4). یکی از کاستی‌‌های مطالعه حاضر عدم دسترسی به نمونه‌های عود‌کننده و سندرمیک و تعداد نمونه کم بود. از مهم‌ترین مشکلات و محدودیت‌های مطالعه ما پرونده‌های ناقص بیماران‌، عدم وجود بافت کافی در تعدادی از بلوک‌ها و نامشخص بودن وضعیت فیکساسیون و آماده‌سازی نمونه‌های قدیمی بود.
نتیجه‌گیری
بروز MDM2 در OKC و کیست دنتی ژروس می‌تواند نشان‌دهنده نقش ثانویه و احتمالی این پروتئین در پاتوژنز‌، رشد و گسترش کیست‌های ادنتوژنیک باشد‌. از طرفی بروز بالاتر این پروتئین در OKC و نواحی سوپرابازال هم تایید‌کننده فرضیه نئوپلاسمیک بودن‌، رفتار بالینی‌، مکانیسم رشدی متفاوت این کیست و حمایت از نام‌گذاری جدید OKC به عنوان نئوپلاسم و هشدار به پزشکان برای درمان کافی با توجه به رفتار بالینی تهاجمی و میزان عود این ضایعه می‌باشد. با استناد به نتایج این مطالعه و مطالعات گذشته و با انجام تحقیقات بیشتر با تعداد نمونه‌های بیشتر در این زمینه می‌توان به نقش احتمالی مهار‌کننده‌های این مارکر و سایر مارکرهای تکثیر سلولی درکنترل و درمان ادنتوژنیک کراتوسیست پرداخت.
سپاس‌گزاری
با تشکر از همه افرادی که در انجام این مطالعه کمک کرده‌اند.
این مطالعه حاصل از پایان‌نامه می‌باشد.
حامی مالی: دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد.
تعارض در منافع:  وجود ندارد.
کد اخلاق و ملاحظات اخلاقی
پروپوزال این تحقیق توسط دانشگاه علوم پزشکی یزد تایید شده است (کد اخلاق IR.SSU.REC.1396.35).

 
 

References:
 
1-    Neville BW، Damm DD، Allen CM، Chi AC. Oral and Maxillofacial Pathology. Elsevier Health Sciences; 2015.
2-    Gadbail AR، Chaudhary M، Patil S، Gawande M. Actual Proliferating Index and P53 Protein Expression as Prognostic Marker in Odontogenic Cysts. Oral Dis 2009; 15(7): 490-8.
3-    Bhargava D، Deshpande A، Pogrel MA. Keratocystic Odontogenic Tumour (KCOT)—A Cyst to a Tumour. Oral Maxillofac Surg 2012; 16(2): 163-70.
4-    Shojaee S، Jamshidi S، Mohtasham N، Roshanaee G، Shahabinejad M. Evaluation of MDM2 and P53 Expression in Dentigerous Cyst and Odontogenic Keratocyst by Immunuhistochemistry. Journal of Mashhad Dental School 2015; 39(2): 163-72. [Persian]
5-    Martínez A، Brethauer U، Borlando J، Spencer ML، Rojas IG. Epithelial Expression of P53، Mdm-2 and P21 in Normal Lip and Actinic Cheilitis. Oral Oncol 2008; 44(9): 878-83.
6-    Regezi JA، Sciubba J، Jordan RC. Oral Pathology: Clinical Pathologic Correlations. Elsevier Health Sciences; 2016.
7-    Sharifi-Sistani N، Zartab H، Babakoohi S، Saghravanian N، Jamshidi S، Esmaili H، et al. Immunohistochemical Comparison of the Expression of P53 and MDM2 Proteins in Ameloblastomas and Keratocystic Odontogenic Tumors. Journal of Craniofacial Surgery 2011; 22(5): 1652-6. [Persian]
8-    Hou H، Sun D، Zhang X. The Role of MDM2 Amplification and Overexpression in Therapeutic Resistance of Malignant Tumors. Cancer Cell Int 2019; 19: 216.
9-    Alaeddini M، Salah S، Dehghan F، Eshghyar N، Etemad-Moghadam S. Comparison of Angiogenesis in Keratocystic Odontogenic Tumours، Dentigerous Cysts and Ameloblastomas. Oral Dis 2009; 15(6): 422-7.
10-    Gadbail AR، Patil R، Chaudhary M. Co-Expression of Ki-67 and P53 Protein in Ameloblastoma and Keratocystic Odontogenic Tumor. Acta Odontol Scand 2012; 70(6): 529-35.
11-    Galvão HC، Gordón-Núñez MA، de Amorim RF، Freitas Rde A، de Souza LB. Immunohistochemical Expression of Protein 53، Murine Double Minute 2، B-Cell Lymphoma 2، and Proliferating Cell Nuclear Antigen in Odontogenic Cysts and Keratocystic Odontogenic Tumor. Indian J Dent Res 2013; 24(3): 369-74.
12-    Sandra F، Nakamura N، Kanematsu T، Hirata M، Ohishi M. The Role of MDM2 in the Proliferative Activity of Ameloblastoma. Oral Oncol 2002; 38(2): 153-7.
13-    Carvalhais J، Aguiar M، Araújo V، Araújo N، Gomez R. P53 and MDM2 Expression in Odontogenic Cysts and Tumours. Oral Dis 1999; 5(3): 218-22.
14-    Saghravanian N، Habibi A، Mohtasham N، AfzalAghaie M، Shiva A، Babazadeh S. Evaluation of MDM2 and P53 Expression in Dentigerous، Radicular and Residual Cysts by Immunuhistochemistry. Journal of Mashhad Dental School 2009; 33(2): 145-52. [Persian]
15-    Piattelli A، Fioroni M، Santinelli A، Rubini C. Expression of Proliferating Cell Nuclear Antigen in Ameloblastomas and Odontogenic Cysts. Oral Oncol 1998; 34(5): 408-12.
16-    Thosaporn W، Iamaroon A، Pongsiriwet S، Ng KH.  A Comparative Study of Epithelial Cell Proliferation between the Odontogenic Keratocyst، Orthokeratinized Odontogenic Cyst، Dentigerous Cyst، and Ameloblastoma. Oral Dis 2004; 10(1): 22-6.
17-    de Oliveira MG، Lauxen Ida S، Chaves AC، Rados PV، Sant'Ana Filho M. Immunohistochemical Analysis Of The Patterns Of P53 And PCNA Expression In Odontogenic Cystic Lesions. Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2008; 13(5): E275-80.
18-    Gaballah ET، Tawfik MA. Immunohistochemical Analysis of P53 Protein in Odontogenic Cysts. Saudi Dent J 2010; 22(4): 167-70.
19-    Piattelli A، Fioroni M، Santinelli A، Rubini C. P53 Protein Expression in Odontogenic Cysts. J Endod 2001; 27(7): 459-61.
20-    Sajeevan TP، Saraswathi TR، Ranganathan K، Joshua E، Rao UD. Immunohistochemical Study of P53 and Proliferating Cell Nuclear Antigen Expression in Odontogenic Keratocyst and Periapical Cyst. J Pharm Bioallied Sci 2014; 6(Suppl 1): S52-7.
21-    Gurgel CA، Ramos EA، Azevedo RA، Sarmento VA، da Silva Carvalho AM، dos Santos JN. Expression of Ki-67، P53 and P63 Proteins in Keratocyst Odontogenic Tumours: An Immunohistochemical Study. J Mol Histol 2008; 39(3): 311-6.
22-    Ogden GR، Chisholm DM، Kiddie RA، Lane DP. P53 Protein in Odontogenic Cysts: Increased Expression in Some Odontogenic Keratocysts. J Clin Pathol 1992; 45(11): 1007-10.
23-    Chandrashekar C، Patel P، Thennavan A، Radhakrishnan R.Odontogenic Keratocyst: Analysis of Recurrence by Agnor، P53 and MDM2 Profiling. J Oral Maxillofac Pathol 2020; 24(1): 184-5.
24-    Ganbariha M، Shahsavari F، Baghaei F. Oral and Maxillofacial Pathology. 3rd ed. Tehran: Ghazal Javan Co;2009: 636-42.