ماهنامه علمی پ‍ژوهشی

مقدمه
پیچش بیضه یک اختلال اورژانسی است که 1 نفر از هر 4000 مرد زیر 25 سال را درگیر می‌کند (1). تظاهرات آن در مردان بالغ به‌صورت درد حاد یک طرفه همراه با حالت تهوع و استفراغ است (2). این بیماری به دلیل پیچ‌خوردگی بیضه حول محور عمودی طناب اسپرماتیک رخ می‌دهد (3). به دنبال این پیچ‌خوردگی، گردش خون بیضه مختل گشته و در نهایت منجر به ادم، ایسکمی و آتروفی بیضه می‌شود (4,5). دو عامل مهم در تعیین زنده‌مانی و عملکرد اسپرم، مدت زمان و شدت پیچش بیضه می‌باشند (6). تنها راه کاهش میزان اختلال عملکرد دائمی بیضه، انجام جراحی اورژانسی واپیچش است (1). این جراحی که به منظور بازگرداندن جریان خون به بیضه ایسکمیک صورت می‌گیرد، منجر به ایجاد آسیب ریپرفیوژن می‌شود (7). این آسیب باعث القا استرس اکسیداتیو، ایجاد پاسخ‌های التهابی، آپوپتوز سلول‌های زایا و درنهایت اختلال در فرآیند اسپرماتوژنز می‌گردد (8,9). اسپرماتوژنز در داخل اپیتلیوم لوله‌های سمینی فروس بیضه اتفاق می‌افتد و درنهایت از طریق مجموعه‌ای از وقایع تکثیری و تمایزی منجر به تولید اسپرم بالغ می‌گردد. مدت زمان این فرآیند در موش سوری 35 روز می‌باشد (10). اسپرماتوگونی‌های As (single) به عنوان سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی در طی فرآیند اسپرماتوژنز شناخته می‌شوند و در مجاورت غشاء پایه لوله‌های اسپرم‌ساز قرار دارند (11). این سلول‌ها با انجام تقسیم میتوز می‌توانند به دو اسپرماتوگونی As تقسیم شوند و جمعیت ذخیره‌ای خود را حفظ کنند یا با ایجاد دو اسپرماتوگونی Apr (pair) تمایز را آغاز نمایند. حاصل تقسیمات میتوزی متوالی این سلول‌ها تولید سلول‌های Apr،Aal (aligned)، سلول‌های در حال تمایز A1-A4، اسپرماتوگونی بینابینی AIn (Intermediate)، اسپرماتوگونی B و اسپرماتوسیت اولیه می‌باشد. به دنبال دو تقسیم میوزی متوالی، اسپرماتوسیت ثانویه و نهایتاً اسپرماتید‌های هاپلوئیدی پدید می‌آیند. اسپرماتید‌ها در مرحله اسپرمیوژنز دچار تغییرات پیچیده مورفولوژیکی و متراکم شدن هسته گشته و در نهایت اسپرم بالغ تولید می‌شود (14-12). پلاکت‌ها قطعات کوچک سلولی بدون هسته‌ای می‌باشند که دارای سه نوع گرانول داخلی به نام‌ گرانول‌ متراکم، لیزوزوم‌‌ و گرانول‌های آلفا هستند. این گرانول‌ها اساس عملکرد پلاکت‌ها را تشکیل می‌دهند (15). گرانول‌های آلفا که قسمت عمده ترشحات پلاکت را به خود اختصاص می‌دهند دارای فاکتورهای مهمی  نظیر فاکتورهای رشد آندوتلیال عروقی، آنژیوژنین و فاکتورهای رشد مختلف مانند فاکتور رشد مشتق از پلاکت، فاکتور رشد اپیدرمی، فاکتور رشد شبه انسولینی و فاکتور رشد تغییر شکل دهنده بتا می‌باشند (18-16). پلاسمای غنی از پلاکت(PRP) ، یک عامل اتولوگ مشتق شده از خون انسان و حیوان است که غنی از پلاکت، فاکتورهای رشد تکثیری، کموتاکتیک، سیتوکین‌ها، هورمون‌ها، فیبرین، فیبرونکتین وغیره است. این محصول خونی منجر به کاهش استرس اکسیداتیو، رادیکال‌های آزاد و افزایش بیان آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی می‌شود (19). بر اساس مطالعه پیشین استفاده از PRP منجر به کاهش آپوپتوز سلول‌های زایاو افزایش میزان فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی پس از آسیب ایسکمی/ ریپرفیوژن بیضه موش صحرایی گردیده است (20). هم‌چنین PRP منجر به بهبودی پارامترهای اسپرمی و ساختار بافتی بیضه موش صحرایی به دنبال تزریق بوسولفان گشت (21). در مطالعات اخیر اثرات PRP بر ناباروری مورد ارزیابی قرار گرفته است و نتایج نشان دادند که PRP در بازسازی بافت، رگ‌زایی، مهاجرت سلولی، تکثیر و تمایز سلول‌های بنیادی، کاهش سطح استرس اکسیداتیو، آسیب DNA اسپرم و بهبودی پارامترهای اسپرم نقش دارد (24-22). پیچش طناب اسپرماتیک یکی از اورژانس‌های اورولوژیک به شمار می‌رود که تنها با عمل جراحی واپیچش قابل اصلاح است. آسیب ایسکمی/ ریپرفیوژن ناشی از پیچش/واپیچش طناب اسپرمااتیک با افزایش سطح استرس اکسیداتیو و القا ROS منجر به آپوپتوز سلول‌های رده اسپرماتوژنیک و اختلال در فرآیند اسپرماتوژنز می‌شود. با توجه به حضور فاکتورهای رشد، پروتئین‌ها و سایتوکین‌های متعدد موجود در PRP به عنوان یکی از مشتقات خونی در دسترس و با نظر به مشکلات روزافزون ناباروری، در این پژوهش اثر تزریق داخل بافت بیضه‌ای PRP بر ساختار هیستومورفومتری لوله-های سمینی فروس و تراکم کروماتین اسپرم موش سوری به دنبال آسیب پیچش/واپیچش طناب  بیضه مورد بررسی قرار گرفت.
روش بررسی
حیوانات آزمایشگاهی
در این مطالعه از 40 سر موش سوری (NMRI) نر، با وزن 25-30 گرم و سن 7-5 هفته استفاده شد. موش‌های سوری از مرکز تکثیر و نگهداری حیوانات آزمایشگاهی انستیتو پاستور ایران تهیه شدند و در شرایط استاندار آزمایشگاهی (چرخه تاریکی/ روشنایی 12 ساعت، دمای 24-22 درجه سانتیگراد، رطوبت نسبی 50 درصد و دسترسی آزاد به آب و غذا) نگه‌داری شدند. تمای مراحل آزمایش‌ها با رعایت دستورالعملهای ثبت شده در کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی تهران صورت گرفت. حیوانات به‌صورت تصادفی در چهار گروه به شرح زیر تقسیم شدند.
گروه کنترل: هیچگونه جراحی در این گروه صورت نگرفت.
گروه پیچش/ واپیچش طناب اسپرماتیک: که طناب اسپرماتیک سمت چپ 720 درجه در خلاف جهت عقربه‌های ساعت چرخانیده و پس از 2 ساعت به حالت اولیه برگردانده شد. جراحی‌ در شرایط استریل با القای بیهوشی توسط کتامین هیدروکلراید با دوز 100 میلی‌گرم بر کیلوگرم و زایلازین با دوز 10 میلی‌گرم بر کیلوگرم به‌صورت تک دوز داخل صفاقی انجام شد. پیچش یک طرفه بیضه با اعمال یک برش خط وسط در ناحیه کیسه بیضه آغاز گشت، بیضه سمت چپ 720 درجه در خلاف جهت عقربه‌های ساعت چرخانده شد. برای حفظ این حالت به مدت 2 ساعت، تونیکا آلبوژینه و دارتوس به یکدیگر بخیه شدند. بعد از 2 ساعت، بیضه ایسکمیک 720 درجه در جهت عقربه‌های ساعت چرخانیده شد و در کیسه بیضه قرار گرفت.
گروه کنترل منفی: در ابتدا عمل جراحی پیچش انجام شد، 30 دقیقه قبل از جراحی واپیچش، 10 میکرولیتر محیط کشت به داخل پارانشیم بیضه تزریق گشت.
گروه درمان با :PRP در ابتدا عمل جراحی پیچش انجام شد، 30 دقیقه قبل از جراحی واپیچش، 10 میکرولیتر PRP به داخل پارانشیم بیضه تزریق گشت (25)(شکل1). پس از گذشت 35 روز (یک سیکل اسپرماتوژنز موش سوری) حیوانات آسان‌کشی شدند و بیضه سمت چپ خارج گشت.
آماده‌سازی PRP: PRP توسط سازمان انتقال خون ایران تهیه گردید. نمونه خون کامل از کاندیدای سالم تهیه گشت و در کیسه‌های حاوی محلول سیترات فسفات دکستروز آدنین به عنوان ماده ضد انعقادی نگه‌داری شد. PRP به روش سانتریفیوژ دو مرحله‌ای استخراج گردید (26).
رنگ آمیزی پریودیک اسید شیف: پس از گذشت یک سیکل اسپرماتوژنز، بافت‌های بیضه سمت چپ سریعاً جدا شد و در فیکساتیو بوئن به مدت 24 ساعت در دمای اتاق قرار گرفتند. آماده‌سازی بافتی شامل آب‌گیری با درصد بالارونده الکل، شفاف‌سازی با گزیلول و قالب‌گیری با پارافین انجام شد. از قالب‌های پارافینی برای انجام رنگ آمیزی PAS برش¬هایی به ضخامت 5 میکرون تهیه و روی لام¬های شیشه‌ای معمولی قرار گرفتند. پس از پارافین‌زدایی و آب‌دهی، اسلایدها  در اسید پریودیک 1% به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند، پس از شستشو با آب جاری، به مدت 15 دقیقه در شیف (سیگما آلدریچ، آلمان) انکوبه گشتند. از هماتوکسیلین مایر به عنوان رنگ افتراقی استفاده شد (27). شمارش سلول¬های اسپرماتوگونی، اسپرماتوسیت اولیه، اسپرماتید گرد، اسپرماتید طویل، سرتولی، لیدیگ و میوئید به کمک مقاطع تهیه شده صورت گرفت. هم چنین به کمک نرم‌افزار Image j اندازه‌گیری قطر خارجی، ضخامت اپی‌تلیوم زایای لوله‌های سمینی فروس و غشای پایه از روی تصاویر تهیه شده انجام شد.
رنگ آمیزی آنیلین بلو: آنیلین بلو به طور انتخابی هیستون‌های غنی از لیزین را رنگ آمیزی می کند در نتیجه می‌تواند درصد اسپرم¬های دارای هیستون اضافی را مشخص نماید. در ابتدا لام اسمیر از نمونه دم اپی¬دیدیم تهیه گشت، سپس لام‌ها در محلول گلوتارآلدهید به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق فیکس شدند. هر اسمیر با آنیلین بلو آبی 5 درصد (مرک، آلمان) در اسید استیک 4 درصد به مدت 7 دقیقه رنگ‌آمیزی گشت (28). حداقل 200 اسپرم از هر نمونه و در نواحی مختلف هر لام با بزرگنمایی 100× شمارش شد. این رنگ‌آمیزی به منظور تعیین درصد تراکم کروماتین غیر طبیعی اسپرم استفاده شد. اسپرم‌های نابالغ با هیستون بیش از حد به رنگ آبی تیره رنگ آمیزی می‌شوند در حالیکه اسپرم‌های آبی کم رنگ ساختار کروماتین طبیعی را نشان می‌دهند. در نتیجه از نسبت تعداد اسپرم‌های آبی تیره به تعداد کل اسپرم‌ها، درصد تراکم کروماتین غیر طبیعی اسپرم مشخص گشت.
تجزیه و تحلیل آماری
تجزیه و تحلیل داده‌ها با استفاده از نرم‌افزارversion 16  SPSS  انجام شد. همه داده‌ها به‌صورت میانگین ± انحراف معیار گزارش شدند. ارزیابی نرمال بودن توزیع داده‌ها با آزمون کولموگروف اسمیرنوف صورت گرفت. آنالیز واریانس یکطرفه ((ANOVA و سپس آزمون توکی برای مقایسات بین گروهی انجام شد و سطح معنی‌دار بودن بین داده‌ها P ≤ 0.05 گزارش گردید.
ملاحظات اخلاقی
این تحقیق بخشی از طرح تحقیقاتی است که توسط دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران تایید شده است (کد اخلاق  IR.TUMS.AEC.1401.016).
نتایج
اثر PRP بر ساختار هیستولوژیک بیضه به دنبال آسیب ناشی از پیچش/ واپیچش طناب اسپرماتیک میانگین تعداد سلول‌های اسپرماتوگونی، اسپرماتوسیت اولیه، اسپرماتید گرد، اسپرماتید طویل، سرتولی، لیدیگ و میوئید به دنبال آسیب ایسکمی-ریپرفیوژن به‌صورت معنی‌داری در مقایسه با گروه کنترل کاهش پیدا کرد (P<0.001)(جدول1). هم‌چنین، لوله‌های سمینی فروس بر اساس میانگین نمره جانسون اسکور درجه‌بندی شدند تا سطح اسپرم‌زایی در هر گروه مشخص شود. نمره جانسون به دنبال آسیب ایسکمی- ریپرفیوژن به‌صورت معنی‌داری در مقایسه با گروه کنترل کاهش پیدا کرد (شکل D3) (P<0.001). علاوه بر این آتروفی و واکوئله شدن لوله‌های سمینی‌فروس، جداشدن غشا پایه و آپوپتوز سلول‌های زایا در تصاویر حاصله به وضوح مشاهده گردید (شکل 2). میانگین قطر و ضخامت اپی‌تلیوم زایای لوله‌های سمینی فروس به دنبال آسیب ایسکمی- ریپرفیوژن به‌صورت معنی‌داری در مقایسه با گروه کنترل کاهش پیدا کرد (P<0.001)(شکلA,B3). در این گروه، میانگین ضخامت غشای پایه لوله‌های سمینی فروس نیز به‌صورت معنی‌داری در مقایسه با گروه کنترل افزایش یافت (P<0.001) (شکل C3). به دنبال درمان PRP، میانگین تعداد سلول‌های اسپرماتوگونی، اسپرماتوسیت اولیه، اسپرماتید گرد، اسپرماتید طویل، سرتولی، میوئید و نمره جانسون به‌صورت معنی‌داری افزایش پیدا کرد (P<0.001)، در حالیکه میانگین تعداد سلول‌ها همچنان تفاوت معنی‌داری در مقایسه با گروه کنترل نشان دادند (P<0.001). این بهبودی در میانگین تعداد سلول‌های سرتولی و میوئید تا گروه کنترل افزایش یافت (جدول 1). به دنبال درمان با PRP افزایش ضخامت اپی‌تلیوم زایا، کاهش واکوئل‌های بافتی، انسجام و ساختار طبیعی لوله-های سمینی فروس قابل رویت می‌باشد (شکل 2). هم‌چنین در میانگین قطر، ضخامت اپی‌تلیوم زایا و ضخامت غشای پایه لوله‌های سمینی فروس موش¬های تحت درمان باPRP  در مقایسه با گروه پیچش/واپیچش بهبودی قابل‌توجهی حاصل گردید (P<0.001)(شکل 3).
اثر PRP بر تراکم کروماتین اسپرم به دنبال آسیب ناشی از پیچش/ واپیچش طناب اسپرماتیک: پس از پیچش طناب اسپرماتیک میانگین درصد اسپرم‌های دارای هیستون اضافه به‌صورت معنی‌داری در مقایسه با گروه کنترل افزایش یافت (P<0.001)(شکل 4). درمان با PRP منجر به بهبودی نسبی تراکم کروماتین گشت و در موش‌های درمان شده با PRP درصد اسپرم‌های دارای هیستون اضافی کاهش معنی¬داری در مقایسه با گروه پیچش/ واپیچش بیضه نشان داد (P<0.001). علی‌رغم این بهبودی، هم‌چنان تفاوت معنی‌داری در مقایسه با گروه کنترل مشاهده گردید.
 



شکل 1: تصویر شماتیک از طراحی مطالعه، زمان جراحی پیچش/واپیچش طناب اسپرماتیک و تزریق PRP

جدول1 : میانگین تعداد سلول‌های لوله‌های سمینی فروس در گروه های مختلف. داده ها به‌صورت میانگین± انحراف معیار گزارش شدند.



 
*               تفاوت معنی دار در مقایسه با گروه پیچش/ واپیچش .(P<0.001)
    # تفاوت معنی دار در مقایسه با گروه درمان با PRP P<0.001)) بجز برای سلول‌های لیدیگ (P<0.01).






شکل 2: تصاویر تهیه شده از مقاطع بافت شناسی لوله‌های سمینی فروس در گروه‌های مختلف. آرایش منظم سلول‌های زایا و ساختار طبیعی لوله‌های سمینی‌فروس در گروه کنترل مشاهده می‌گردد. در گروه پیچش/ واپیچش و کنترل منفی، لوله‌های سمینی‌فروس آتروفی گشته، سلول‌های زایا دچار آپوپتوز شده و جداشدگی غشا پایه رویت گردید. بهبودی قابل توجهی در ساختار اپی‌تلیوم زایای لوله‌ها به دنبال تزریق PRP مشاهده گردید. رنگ¬آمیزی پریودیک اسید شیف و بزرگنمایی X400.




شکل 3: نمودارهای مربوط به میانگین قطر، ضخامت اپی‌تلیوم لوله‌های سمینی‌فروس، ضخامت غشا پایه و نمره جانسون در گروه‌های مختلف.
p<0.001::*** تفاوت معنی‌دار در مقایسه با گروه پیچش/ واپیچش.
p<0.001:###: تفاوت معنی‌دار در مقایسه با گروه درمان با PRP و p<0.01:##: تفاوت معنی‌دار در مقایسه با گروه درمان با PRP.





شکل 4: میانگین درصد اسپرم‌های دارای هیستون اضافه در گروه‌های مختلف. میانگین درصد اسپرم‌های دارای هیستون باقی‌مانده در گروه درمان با PRP به‌صورت معنی¬داری در مقایسه با گروه پیچش/ واپیچش کاهش یافت.
p<0.001:***: تفاوت معنی‌دار در مقایسه با گروه پیچش/ واپیچش.  p<0.001: ###: تفاوت معنی¬دار در مقایسه با گروه درمان با PRP.
 
بحث
پیچ‌خوردگی بیضه یک بیماری حاد پیشرونده است که معمولاً نوزادان پسر، کودکان و نوجوانان را درگیر می‌کند. این اختلال ناشی از چرخش طناب اسپرماتیک می‌باشد که منجر به اختلال در جریان خونرسانی، هایپوکسی و ایسکمی بیضه می‌گردد (29). تشخیص زودهنگام و انجام جراحی واپیچش، برای بازگرداندن جریان خون، جلوگیری از نکروز و از دست دادن عملکرد بیضه ضروری است (30). بازگشت جریان خون پس از انجام جراحی واپیچش بیضه، منجر به القا استرس اکسیداتیو، تولید رادیکال‌های آزاد، افزایش سطح ROS، پراکسیداسیون لیپیدی، افزایش سیتوکین‌های التهابی و آسیب به رگ‌های خونی می‌گردد (33-31). به عبارتی آسیب ایسکمی-ریپرفیوژن ناشی از پیچش/ واپیچش طناب اسپرماتیک منجر به اختلال در فرآیند اسپرماتوژنز، آپوپتوز در سلول‌های زایا و آتروفی بیضه می‌شود. اگرچه درمان قطعی برای ایسکمی- ریپرفیوژن وجود ندارد، اما مداخلاتی نظیر جلوگیری از تولید رادیکال‌های آزاد، استفاده از مهارکننده‌های آنزیم تبدیل‌کننده آنژیوتانسین و مصرف داروهایی نظیر عوامل ضد التهابی، مورفین و استاتین‌ها برای کاهش عوارض این اختلال پیشنهاد می‌شود (34). نتایج مطالعات مختلف نشان می‌دهد که مصرف آنتی اکسیدان‌ها و ترکیبات مهار‌کننده رادیکال‌های آزاد اثرات محافظتی بر آسیب ایسکمی-ریپرفیوژن دارند (33,35,36). در این مطالعه از پیچش بیضه 2 ساعته با چرخش 720 درجه در خلاف جهت عقربه‌های ساعت برای ایجاد یک آسیب خفیف تا متوسط در بیضه چپ ایجاد گشت، نتایج مطالعه‌ی حاضر کاهش قابل توجه سلول‌های لوله‌های سمینی فروس و کاهش نمره جانسون را نشان داد. هم راستا با یافته¬های ما، نتایج Shih و همکاران در سال 2021 نشان داد که پیچش بیضه منجر به آسیب غشا داخلی میتوکندری، کاهش بیان پروتئین‌های آن و در نتیجه اختلال در عملکرد تنفس سلولی و زنده مانی سلول¬های زایا می‌گردد (37). هم‌چنین افزایش سطح FSH، LH و کاهش تولید تستوسترون و نمره جانسون در یافته‌های مطالعه Kutluhan و همکاران در سال 2021 به دنبال ایجاد پیچش/واپیچش بیضه رت گزارش گردید (38) که هم راستا با گزارشات مطالعه ما در کاهش میانگین تعداد سلول‌های لیدیگ و نمره جانسون در گروه پیچش/ واپیچش مدل موش سوری می‌باشد. یافته‌های Samy و همکاران در سال 2020 افزایش سطح نیتریک اکسید، مالون دی آلدئید، کاسپاز3، اینترلوکین 1، فاکتور نکروز کننده تومور آلفا و کاهش عملکرد کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز را نشان دادند (20). به عبارتی پیچش واپیچش طناب اسپرماتیک از طریق القا استرس اکسیداتیو و کاهش عملکرد آنزیم‌های آنتی اکسیدانی منجر به آپوپتوز سلول¬های زایا و آتروفی لوله¬های سمینی فروس می‌گردد که تصاویر بافتی مطالعه حاضر تاییدی بر این یافته است.  PRPبه دلیل خواص درمانی خود به عنوان یک راهکار بیولوژیکی قوی در سال¬های اخیر برای ترمیم بافت‌ها مورد توجه قرار گرفته است. اعتقاد بر این است که سایتوکاین‌ها و فاکتورهای رشد موجود در گرانول‌های پلاکتی منجر به افزایش تکثیر و تمایز سلولی گشته و در نتیجه تاثیر بالقوه‌ای در ترمیم بافت دارند (39,40). PRP یک آنتی‌اکسیدان قوی است که از آسیب ایسکمی- ریپرفیوژن در مغز، قلب و کلیه  نیز محافظت می-کند. علاوه بر این تا کنون هیچگونه اثر نامطلوبی از PRP بر باروری مردان گزارش نگردیده است (41). بنابراین، ما در مطالعه اخیر برای اولین بار اثرات حفاظتی تزریق داخل بیضه PRP را در مقابل آسیب ایسکمی- ریپرفیوژن بیضه موش سوری مورد ارزیابی قرار دادیم. Gazia و همکاران اثر محافظتی PRP در برابر آسیب ایسکمی- ریپرفیوژن بیضه رت را مورد مطالعه قرار دادند. مشابه با یافته‌های مطالعه ما بهبود ساختار بافتی و مورفولوژی لوله‌های سمینی فروس و افزایش میانگین تعداد سلول‌های اسپرماتوژنیک پس از تزریق داخل بافتی PRP گزارش گردید. علاوه بر این در این مطالعه بهبودی در سطح آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی و کاهش استرس اکسیداتیو به دنبال درمان با PRP مشاهده گشت. PRP با کاهش سطح گونه¬های اکسیژن فعال، آسیب بیضه را کاهش می‌دهد (42). علاوه بر این در سال 2010، پس از اعمال پیچش بیضه در رت از Varenicline به عنوان یک سرکوب‌گر سیستم ایمنی مرکزی استفاده گشت و نتایج نشان داد که Varenicline نه تنها آسیب ایسکمی- ریپرفیوژن بیضه را کاهش می دهد بلکه از آتروفی و فیبروز طولانی مدت بیضه جلوگیری می‌کند (43). به عبارتی مکانیسم اصلی بهبود آسیب ناشی از پیچش/ واپیچش مصرف عواملی است که بتوانند نقش ضد التهابی و آنتی اکسیدانی داشته باشند و میزان استرس اکسیداتیو را کاهش دهند. نتایج مطالعه ما کاهش درصد اسپرم‌ها با هیستون اضافی را به دنبال تزریق PRP نشان دادند، Yan و همکاران از PRP در محیط فریز اسپرم استفاده کردند که نتایج این مطالعه بهبود عملکرد میتوکندری و ساختار کروماتین اسپرم را هم‌راستا با یافته‌های ما علاوه بر بهبود پارامترهای اسپرمی گزارش کرد. مطالعات نشان داده‌اند که تعاملات بین فاکتورهای رشد از طریق ایجاد تعادل بین تکثیر و تمایز سلول‌های زایا در تنظیم بقا و زنده مانی این سلول‌ها نقش دارند (44). به عنوان مثال، فاکتور رشد فیبروبلاستی منجر افزایش تقسیمات میوزی سلول‌های زایای تخمدانی گشت (45). هم چنین فاکتور رشد تغییر شکل دهنده بتا در تنظیم تقسیمات میوزی اسپرماتوسیت‌ها دخیل است. در مطالعه دهقانی و همکاران گزارش گردید فاکتورهای رشد پلاکتی منجر به رهایش سریعتر اسپرم در لوله‌های سمینی‌فروس می گردد، هم چنین پلاکت‌ها به دلیل دارا بودن عوامل دخیل در رگ زایی باعث اصلاح الگوی خونرسانی به بیضه شده و افزایش توان آنتی اکسیدانی بافت را به همراه دارد (21). در این مطالعه به دنبال مصرف PRP بعد از القا مدل آزواسپرمی با بوسولفان افزایش تعداد سلول‌های رده اسپرماتوژنیک و بهبود پارامترهای اسپرم نیز گزارش گردید. نتایج مطالعه ما نشان داد که بعد از تزریق داخل بیضه PRP پارامترهای اسپرماتوژنز و درصد اسپرم‌های دارای هیستون اضافه هم‌چنان تفاوت معنی‌داری در مقایسه با گروه کنترل نشان دادند، بنابراین بررسی‌ در زمان‌های طولانی‌تر و تزریق مکرر PRP یا افزایش دوز آن در مطالعات آینده پیشنهاد می‌گردد. با توجه به وجود محدودیت‌های مطالعه اخیر، اندازه‌گیری غلظت فاکتورهای رشد پلاکتی، ارزیابی آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی، بررسی دقیق بیان ژن‌هاو پروتئین‌های درگیر در مسیرهای آپوپتوز برای شناخت دیگر اثرات درمانی PRP در بررسی‌های آینده کمک کننده است.
نتیجه‌گیری
با توجه نتایج این مطالعه و پژوهش‌های پیشین، حضور فاکتورهای رشد متعدد، پروتئین‌ها و سیتوکین‌های ترشحی گرانول‌های پلاکتی منجر به کاهش استرس اکسیداتیو و آپوپتوز سلول‌های زایا و درنهایت پیشبرد اسپرماتوژنز می‌گردد. پیچش طناب اسپرماتیک از اختلالات جدی در زمینه باروری مردان است که تا کنون پروتکل درمانی قطعی برای آن ارائه نشده است. استفاده از PRP به عنوان محصول خونی اتولوگ از فرد در درمان این اختلال می‌تواند کمک کننده باشد. علی رغم اینکه نقش PRP در درمان ناباروری مردان نتایج چشمگیری به همراه داشته است اما پتانسیل درمانی و مکانیسم عملکرد آن مشخص نشده است.
سپاس‌گزاری
مولفین مراتب سپاس خود را از معاونت محترم تحصیلات تکمیلی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران جهت حمایت از این تحقیق ابراز می‌دارند. این مقاله از طرح تحقیقاتی مقطع کارشناسی ارشد به راهنمایی خانم دکتر فرناز خدیوی و خانم نگارش محیا رمش استخراج گردیده است.
حامی مالی: مطالعه حاضر مستخرج از طرح تحقیقاتی مصوب در دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران است. منابع مالی این مطالعه بر اساس مقررات مربوط به طرح پایان‌نامه تأمین شده است.
تعارض در منافع: وجود ندارد.
 
 

References:
 
1-    Mansbach J, Forbes P, Peters C. Testicular Torsion and Risk Factors for Orchiectomy. J Adolescent Health 2004; 34(2): 143-4.
2-    Sheth KR, Keays M, Grimsby GM, Granberg CF, Menon VS, DaJusta DG, et al. Diagnosing Testicular Torsion Before Urological Consultation and Imaging: Validation of the TWIST Score. J Urol 2016: 195(6): 1870-6.
3-    Hamed GM, Ahmed RM, Emara MM, Mahmoud MH. Effect of Erythropoietin on Experimental Unilateral Testicular Torsion Detorsion in Rat Model. Life Sci J 2011; 8(2): 405-12.
4-    Cox AM, Patel H, Gelister J. Testicular Torsion. British Journal of Hospital Medicine 2012; 73(sup3): C34-6.
5-    Afolabi O, Alabi B, Omobowale T, Oluranti O, Iwalewa O. Cysteamine Mitigates Torsion/Detorsion‐Induced Reperfusion Injury Via Inhibition of Apoptosis. Oxidative Stress and Inflammatory Responses in Experimental Rat Model. Andrologia 2022; 54(1): e14243.
6-    Hsiao CH, Ji AT, Chang CC, Chien MH, Lee LM, Ho JH. Mesenchymal Stem Cells Restore the Sperm Motility from Testicular Torsion-Detorsion Injury by Regulation of Glucose Metabolism in Sperm. Stem Cell Res Ther 2019; 10(1): 270.
7-    Ahmed FA, Whelan J, Jequier AM, Cummins JM. Torsion‐Induced Injury in Rat Testes Does Not Affect Mitochondrial Respiration or the Accumulation of Mitochondrial Mutations. Int J Androl 2000;  23(6): 347-56.
8-    Lysiak JJ, Turner SD, Nguyen QA, Singbartl K, Ley K, Turner TT. Essential Role of Neutrophils in Germ Cell-Specific Apoptosis Following Ischemia/Reperfusion Injury of the Mouse Testis. Biol Reprod 2001; 65(3): 718-25.
9-    Zhong L, Yang M, Zou X, Du T, Xu H, Sun J. Human Umbilical Cord Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Alleviate Acute Ischemia-Reperfusion Injury of Spermatogenic Cells Via Reducing Inflammatory Response and Oxidative Stress. Stem Cell Res Ther 2020; 11(1): 294.
10-    Griswold MD. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiol Rev 2016; 96(1): 1-17.
11-    Nakata H. Morphology of Mouse Seminiferous Tubules. Anat Sci Int 2019; 94(1): 1-10.
12-    Brinster RL, Nagano M. Spermatogonial Stem Cell Transplantation, Cryopreservation and Culture. Semin Cell Dev Biol 1998; 9(4): 401-9.
13-    Kolasa A, Misiakiewicz K, Marchlewicz M, Wiszniewska B. The Generation of Spermatogonial Stem Cells and Spermatogonia in Mammals. Reprod biol 2012; 12(1): 5-23.
14-    Dym M, Kokkinaki M, He Z. Spermatogonial Stem Cells: Mouse and Human Comparisons Birth Defects Res C Embryo Today 2009; 87(1): 27-34.
15-    Coppinger JA, Cagney G, Toomey S, Kislinger T, Belton O, McRedmond JP, et al. Characterization of the Proteins Released from Activated Platelets Leads to Localization of Novel Platelet Proteins in Human Atherosclerotic Lesions. Blood 2004; 103(6): 2096-104.
16-    Dhurat R, Sukesh M. Principles and Methods of Preparation of Platelet-Rich Plasma: A Review and Author's Perspective. J Cutan Aesthet Surg 2014; 7(4): 189-97.
17-    Raja VS, Naidu EM. Platelet-Rich Fibrin: Evolution of a Second-Generation Platelet Concentrate. Indian J Dent Res 2008; 19(1): 42-6.
18-    Boswell SG, Cole BJ, Sundman EA, Karas V, Fortier LA. Platelet-Rich Plasma: A Milieu of Bioactive Factors. Arthroscopy 2012; 28(3): 429-39.
19-    Martins RP, Hartmann DD, de Moraes JP, Soares FA, Puntel GO. Platelet-Rich Plasma Reduces the Oxidative Damage Determined by a Skeletal Muscle Contusion in Rats. Platelets 2016; 27(8): 784-90.
20-    Samy A, El-Adl M, Rezk S, Marghani B, Eldomany W, Eldesoky MA. The Potential Protective and Therapeutic Effects of Platelet-Rich Plasma on Ischemia/Reperfusion Injury Following Experimental Torsion/Detorsion of Testis in the Albino Rat Model. Life Sci 2020; 256: 117982.
21-    Dehghani F, Sotoude N, Bordbar H, Panjeshahin MR, Karbalay-Doust S. The Use of Platelet-Rich Plasma (PRP) to Improve Structural Impairment of Rat Testis Induced by Busulfan. Platelets 2019; 30(4): 513-20.
22-    Aghajanova L, Houshdaran S, Balayan S, Manvelyan E, Irwin JC, Huddleston HG, et al. In Vitro Evidence That Platelet-Rich Plasma Stimulates Cellular Processes Involved In Endometrial Regeneration. J Assist Reprod Genet 2018; 35(5): 757-70.
23-    Tobita M, Tajima S, Mizuno H. Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells and Platelet-Rich Plasma: Stem Cell Transplantation Methods that Enhance Stemness. Stem Cell Res Ther 2015; 6: 215.
24-    Bader R, Ibrahim JN, Moussa M, Mourad A, Azoury J, Azoury J, et al. In Vitro Effect of Autologous Platelet‐Rich Plasma on H2O2‐Induced Oxidative Stress in Human Spermatozoa. Andrology 2020; 8(1): 191-200.
25-    Abdollahifar MA, Azad N, Faraji Sani M, Raoofi A, Abdi S, Aliaghaei A, et al. Impaired Spermatogenesis Caused by Busulfan is Partially Ameliorated by Treatment with Conditioned Medium of Adipose Tissue Derived Mesenchymal Stem Cells. Biotech Histochem 2022; 97(2): 107-17.
26-    Khadivi F, Koruji M, Akbari M, Jabari A, Talebi A, Ashouri Movassagh S, et al. Application of Platelet-Rich Plasma (PRP) Improves Self-Renewal of Human Spermatogonial Stem Cells in Two-Dimensional and Three-Dimensional Culture Systems. Acta Histochem 2020; 122(8): 151627.
27-    Ahmed EA, Rooij DG. Staging of Mouse Seminiferous Tubule Cross-Sections. Methods Mol Biol 2009; 558: 263-77.
28-    Hammadeh ME, Zeginiadov T, Rosenbaum P, Georg T, Schmidt W, Strehler E. Predictive Value of Sperm Chromatin Condensation (Aniline Blue Staining) in the Assessment of Male Fertility. Arch Androl 2001; 46(2): 99-104.
29-    Günther P, Rübben I. The Acute Scrotum in Childhood and Adolescence. Deutsch Ärztebl Int 2012; 109(25): 449-57.
30-    Lian BS, Ong CC, Chiang LW, Rai R, Nah SA. Factors Predicting Testicular Atrophy after Testicular Salvage Following Torsion. Eur J Pediatr Surg 2016; 26(1): 17-21.
31-    Carden DL, Granger DN. Pathophysiology of Ischaemia–Reperfusion Injury. J pathology 2000; 190(3): 255-66.
32-    Chi KK, Zhang WH, Wang GC, Chen Z, He W, Wang SG, et al. Comparison of Intraperitoneal and Intraepididymal Quercetin for The Prevention of Testicular Torsion/Detorsion-Induced Injury. Urology 2017; 99: 106-11.
33-    Wei SM, Yan ZZ, Zhou J. Protective Effect of Rutin on Testicular Ischemia-Reperfusion Injury. J Pediatr Surg 2011; 46(7): 1419-24.
34-    Oldenburg O, Qin Q, Krieg T, Yang XM, Philipp S, Critz SD, et al. Bradykinin Induces Mitochondrial ROS Generation Via NO, Cgmp, PKG, and Mitokatp Channel Opening and Leads to Cardioprotection. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2004; 286(1): H468-H476.
35-    Unal D, Yeni E, Erel O, Bitiren M, Vural H. Antioxidative Effects of Exogenous Nitric Oxide Versus Antioxidant Vitamins on Renal Ischemia Reperfusion Injury. Urol Res 2002; 30(3): 190-94.
36-    Dokmeci D, Kanter M, Inan M, Aydogdu N, Basaran UN, Yalcin O, et al. Protective Effects of Ibuprofen on Testicular Torsion/Detorsion-Induced Ischemia/Reperfusion Injury in Rats. Archives of Toxicology 2007; 81(9): 655-63.
37-    Shih HJ, Chang CY, Huang IT, Tsai PS, Han CL, Huang CJ. Testicular Torsion–Detorsion Causes Dysfunction of Mitochondrial Oxidative Phosphorylation. Andrology 2021; 9(6): 1902-10.
38-    Kutluhan MA, Özsoy E, Şahin A, Ürkmez A, Topaktaş R, Toprak T, Gümrükçü G, Verit A. Effects of Platelet‐Rich Plasma on Spermatogenesis and Hormone Production in an Experimental Testicular Torsion Model. Andrology 2021; 9(1): 407-13.
39-    Dogan C, Halici Z, Topcu A, Cadirci E, Karakus E, Bayir Y, et al. Effects of Amlodipine on Ischaemia/Reperfusion Injury in the Rat Testis. Andrologia 2016; 48(4): 441-52.
40-    Agarwal A. Said TM. Oxidative Stress, DNA Damage and Apoptosis in Male Infertility: A Clinical Approach. BJU Int 2005; 95(4): 503-7.
41-    Salem N, Helmi N, Assaf N. Renoprotective Effect of Platelet-Rich Plasma on Cisplatin-Induced Nephrotoxicity in Rats. Oxid Med Cell Longev 2018; 2018: 9658230.
42-    Gazia MA. Histological Study on the Possible Ameliorating Effect of Platelet Rich Plasma on Ischemia/Reperfusion Injury in Testicular Torsion Model in Adult Albino Rat. Egyptian J Histology 2020; 43(2): 614-29.
43-    Ho C, Zee RS, Omidi N, Bayne C, Hester A, Mukherjee E, et al. Varenicline Limits Ischemia Reperfusion Injury Following Testicular Torsion in Mice. J Pediat Urol 2021; 17(5): 631.e1-631.e8.
44-    Feng CW, Bowles J, Koopman P. Control of Mammalian Germ Cell Entry Into Meiosis. Mol Cell Endocrinol 2014; 382(1): 488-97.
45-    He B, Lin J, Li J, Mi Y, Zeng W, Zhang C. Basic Fibroblast Growth Factor Suppresses Meiosis and Promotes Mitosis of Ovarian Germ Cells in Embryonic Chickens. Gen Comp Endocrinol 2012; 176(2): 173-81.