ماهنامه علمی پ‍ژوهشی

مقدمه
پس از تولد تا حدود 18 سالگی، دوران تحرک فرایندهای بیولوژیکی برای رسیدن به بلوغ و وضعیت بزرگسالی است. در این دوران، رشد عضلانی با هایپرتروفی و تا حدودی هایپرپلازی در گونه انسان همراه است در این محدوده زمانی، همراه با رشد پیکری، آهنگ تغییرات به سمت بالیدگی نیز دارای اهمیت می‌باشد (1). با این حال در نمونه‌های حیوانی دوران رشد علاوه بر هایپرتروفی با هایپرپلازی عضلانی همراه است (2). پس از ورود به مرحله جوانی و میانسالی تغییرات چندانی در رشد سیستم عضلانی رخ نمی‌دهد. مگر اینکه انسان با تغییرات مربوط به سلامتی، تغذیه و فعالیت بدنی مواجه شود که هایپرتروفی یا آتروفی عضلانی از پیامد‌های آن خواهد بود که خود دلالت بر پویایی بافت عضلانی دارد (3). پس از میانسالی، سالمندی آخرین مرحله از زندگی است که در آن تغییرات به سمت رشد منفی پیش می رود. یکی از اختلالات مهم و شایع سالمندان، آتروفی عضلانی وابسته به سن است که با کاهش چشمگیر در توانایی تولید نیرو و کاهش حجم توده عضلانی همراه است (4). به طور کلی، کاهش فعالیت‌های جسمانی (‌سبک زندگی بی‌تحرک)، تغییر در عملکرد غدد درون‌ریز، کاهش عملکرد عصبی عضلانی، تغییر در متابولیسم پروتئین (‌عدم تعادل بین سنتز پروتئین در مقابل تجزیه پروتئین)، تغذیه ( به‌ویژه اسیدهای آمینه)، آپوپتوز و بیماری‌ها یا آسیب منجر به آتروفی عضلات می‌گردد (5). در مطالعه فیلیپس و همکاران (2017) نشان داده شد بین سن و رشد عضلات سه گروه جوان، میانسال و سالمند رابطه منفی وجود دارد (6). دیشن و همکاران (2011) با هدف بررسی اثر پیری بر سازگاری پیوندگاه عصبی عضلانی NMJ به تمرینات استقامتی انجام شد نشان دادند که تغییرات در NMJ و از بین رفتن عصب در تارهای عضلانی قبل از آتروفی عضلانی اتفاق می‌افتد (7). همراه با رشد عضلات، بخش حرکتی سیستم عصبی هم دستخوش تغییرات می‌شود (8). حفظ مناسب عملکرد سیناپسی تحت تاثیر تغییرات محیط اطراف سیناپس است. این تغییرات از سازماندهی موضعی استحکام سیناپسی تا سازماندهی گسترده پایانه‌های آکسونی متغیر است (9). در همین راستا نشان داده شده است که دسته‌ای از نشانگان هدایت آکسونی به نام سمافورین‌ها که از پایانه‌های آکسونی بیان می‌شوند، می‌تواند بر انسجام پیوندگاه عصبی – عضلانی (NMJ) اثرگذار باشد (11،10). Sema3a یکی از اعضای این خانواده است که می‌تواند موجب دفع آکسون از بافت عضلانی گردد (11,12). از دیگر عوامل مهم درگیر در رشد آکسونی، مولکول‌های چسبان عصبی هستند که NCAM نامیده می‌شوند. این مولکول‌ها تنها در سلول‌های عصبی بیان می شوند (13). به نظر می‌رسد که کاهش NCAM یکی از فاکتورهای دخیل در نارسایی های عصبی – عضلانی به شمار می‌رود (14). در مطالعه‌ای با هدف بررسی تاثیر تمرین بر مورفولوژی پیوندگاه عصبی – عضلانی در موش‌های جوان و پیر انجام شد، نشان داده شد که پیری تاثیر عمده ای بر پیوندگاه عصبی عضلانی عضله پلانتاریس و EDL نداشت ولی آتروفی چشمگیری در هر دو عضله بر اثر پیری مشاهده شد (15). در تحقیق دیگری قدیری و همکاران (2017) نشان داده شده است که با افزایش سن موش های سالمند، بیان ژن sema3a در عضله باز کننده طویل انگشتان پا افزایش یافت (16). طیبی و همکاران (2019) در پژوهشی که به بررسی تاثیر تمرین تناوبی شدید بر سطح مقطع تارهای عضلانی و بیان ژن تخریب‌کننده عضلات در عضله پلانتاریس موش‌های سالمند نشان دادند که افزایش سن، NCAM را به میزان قابل‌توجهی کاهش می‌دهد (17). اما تا به امروز نقش گذر زمان و سن بر تغییرات عصبی عضلانی از کودکی تا پیری نپرداخته است. بنا براین پژوهش حاضر با هدف بررسی تاثیر گذر زمان و سن بر تغییرات موفولوژیک موش‌های صحرایی‌نر انجام شده است.
روش بررسی
پژوهش حاضر از نوع تجربی بود. 15 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار در سه رده سنی 2 هفته ای (150 – 100 گرم)، 6 هفته‌ای (250 – 220 گرم) و 96 هفته‌ای (320 – 280 گرم) در محیطی با دمای 2±23 درجه سانتی‌گراد، رطوبت 45 تا 55 درصد و چرخه تاریکی به روشنایی 12:12 ساعته نگهداری شدند. در طی پژوهش غذای استاندارد پلت و آب به صورت آزاد در اختیار آن‌ها قرار گرفت. 48 ساعت پس از 6 هفته موش‌ها با استفاده از گاز CO2 بیهوش و کشته شدند و در محیط کاملاً استریل با استفاده از تیغ جراحی و ایجاد برش در قسمت خلفی ساق پای آنها، عضله نعلی (17)(commented m1) استخراج گردید عضله پای راست بلافاصله در نیتروژن مایع منجمد شد و سپس جهت انجام آزمایشات سلولی و مولکولی در یخچال 80- نگهداری شد. و عضله پای چپ برای انجام آزمایشات هیستوشیمیایی در فرمالین 10 درصد تا انجام قالب‌گیری در دمای اتاق نگهداری شد. به منظور بررسی بیان پروتئین های sema3a و NCAM (commented m2) از روش ایمونوهیستوشیمیایی با استفاده از آنتیبادیهای ASC, NLRP3 و Caspase-1 (commented m4) در عضله و محل اتصال عصبی – عضلانی استفاده گردید. ابتدا ناحیه پیوندگاه عصبی عضلانی رنگ آمیزی شد. نمونه‌ها با سالین بافر فسفات (PBS) در 4 مرحله و به فاصله 5 دقیقه شسته شدند. به منظور باز یابی آنتی ژنی بر روی نمونه ها اسیدکلریدریک 2 نرمال به مدت 30 دقیقه ریخته شد. بافر بورات به منظور خنثی سازی اسید به مدت 5 دقیقه اضافه گردید. سلول¬ها با PBS شسته شدند. تریتون 3/0 درصد به مدت 30 دقیقه به منظور نفوذ‌پذیر کردن غشاء سلول‌ها استفاده گردید. با PBS شستشو داده شدند. سرم بز 10 درصد برای مدت 30 دقیقه به منظور بلوک‌کردن واکنش آنتی‌بادی ثانویه به صورت رنگ اضافی زمینه اضافه شد. آنتی‌بادی اولیه رقیق شده (1 به 100) با PBS به نمونه اضافه گردید و بعد از ایجاد یک محیط مرطوب برای جلوگیری از خشک شدن بافت به مدت یک شب درون یخچال با دمای 2 تا 8 درجه قرار داده شد. روز بعد ظرف حاوی بافت از یخچال خارج شد و سپس 4 بار و هر بار به مدت 5 دقیقه با PBS شستشو داده شدند. به نمونه آنتی‌بادی ثانویه با رقت 1 به 150 اضافه گردید و سپس در انکوباتور با دمای 37 درجه به مدت 1 ساعت و 30 دقیقه در تاریکی انکوبه شدند. بعد از آن نمونه از انکوباتور به اتاق تاریک منتقل گردید و بعد از 4 بار شستشو، به آن¬ها DAPI اضافه گردید، بلافاصله برداشته شد و روی نمونه PBS ریخته شد. در مرحله آخر نمونه توسط میکروسکوپ فلوروسنت مدل Olympus و با لنز 400 برای تایید مارکرها مشاهده شدند (Commented m4, m5). به منظور اندازه‌گیری سطح مقطع عرضی تارهای عضلانی، نمونه‌های عضلانی که در فرمالین 10% فیکس شده بودند، در پارافین قالب‌گیری شده و سپس به قطعاتی با ضخامت 5 میکرومتر برش داده شدند و با هماتوکسیلین  Hematoxylin و ائوزین Eosin(H&E) رنگ آمیزی شدند. عکس برداری فتو میوگرافی با استفاده از میکروسکوپ نوری طیف عادی Olympus DP72 با بزرگنمایی X400 با دوربین دیجیتال (Olympus ,Tokyo ,Japan) انجام شد. پس از عکس‌برداری، اندازه‌گیری سطح مقطع تار عضلانی با استفاده از نرم افزار دی جی مایزر (Digimizer v4.1.1.0, medcalc software) انجام شد. به طور میانگین 200-150 تار عضلانی از هر عضله برای مشخص کردن اندازه سطح مقطع عرضی، تجزیه و تحلیل شد.
تجزیه و تحلیل آماری
جهت تعیین معنی‌دار بودن تفاوت بین گروه‌ها از تحلیل واریانس یک طرفه (‌ANOVA) و آزمون تعقیبی توکی استفاده شد. سطح معنی‌داری نیز 0/05≥p در نظر گرفته شد. کلیه بررسی‌های آماری با استفاده از نرم افزار Prism 5 انجام گرفت .(Commented m5)
ملاحظات اخلاقی
این پژوهش در آزمایشگاه موسسه بافت و ژنتیک پاسارگاد تهران و با نظارت اساتید فیزیولوژی و متخصصین آزمایشگاهی و نیز با رعایت کلیه اصول اخلاقی انجام شد. شایان ذکر است که کلیه اصول اخلاقی پژوهش حاضر مطابق با اصول کار با حیوانات آزمایشگاهی مصوب کمیته اخلاق دانشگاه آزاد اسلامی واحد رشت با کد اخلاق IR.IAU.RASHT.REC.1399.029 تایید گردید.
نتایج
ویژگی موش‌ها در رده‌های سنی کودک، جوان و سالمند در جدول 1 نشان داده شده است. تغییرات سطح مقطع عضلانی در نمودار 1. نشان داده شده است. نتایج حاکی از آن است که در سطح مقطع تارهای عضلانی بین کودک و جوان (0/01=p)، کودک و سالمند (0/049=p) و جوان و سالمند (0/049=p) تفاوت معنی‌داری وجود دارد (Commented m7). تغییرات مربوط به هایپرپلازی عضلانی در نمودار 2. نشان داده شده است. نتایج نشان داد که کاهش معنی‌دار تعداد تارهای عضلانی در رده سنی سالمند نسبت به رده سنی کودک (0/012=p) و سالمند نسبت به جوان (0/001=p) وجود دارد. همانگونه که در نمودار 3. نشان داده شده است، بیان پروتئین sema3a با توجه به گذر زمان بین کودک و جوان (0/048=p)، کودک و سالمند (0/0001=P) و جوان و سالمند (0/0001=P) افزایش معنی‌داری وجود دارد (Commented m7). هم‌چنین نتایج پژوهش نشان داد که بیان پروتئین NCAM با توجه به گذر زمان در سه رده سنی کودک و جوان (0/048=p)، کودک و کنترل (0/0001=p) و جوان و سالمند (0/001=p) کاهش معنی‌دار داشت.
 

جدول 1: مقادیر وزن در گروه‌های پژوهش

                                        *: تفاوت معنی دار نسبت به پیش آزمون





نمودار1: هایپرتروفی عضلانی گروه‌های پژوهش. داده‌ها به‌صورت میانگین و انحراف استاندار نشان داده شده‌اند.
سطح معنی‌داری (0/05≥p) در نظر گرفته شده است. Week: هفته. *: تفاوت معنی‌دار




شکل 1: تغییرات سطح مقطع تارهای عضله نعلی در رده‌های سنی مختلف با بزرگنمایی 200، 100 و 20 میکرومتر (Commented m8, m9)




نمودار2: هایپرپلازی عضلانی گروه‌های پژوهش. داده‌ها به‌صورت میانگین و انحراف استاندار نشان داده شده‌اند.
سطح معنی‌داری (0/05≥p) در نظر گرفته شده است. Week: هفته. *: تفاوت معنی‌دار




شکل 2: تغییرات تعداد تارهای عضله نعلی در رده‌های سنی مختلف با بزرگنمایی 200، 100 و 20 میکرومتر (Commented m8, m9)






نمودار3: بیان پروتئین sema3a گروه‌های پژوهش. داده‌ها به‌صورت میانگین و انحراف استاندار نشان داده شده‌اند.
سطح معنی‌داری (0/05≥p) در نظر گرفته شده ‌است. Week: هفته. *: تفاوت معنی‌دار



شکل 3: بیان پروتئین sema3a تارهای عضله نعلی در ردههای سنی مختلف





نمودار4: بیان پروتئین NCAM گروه‌های پژوهش. داده‌ها به‌صورت میانگین و انحراف استاندار نشان داده شده‌اند.
سطح معنی‌داری (0/05≥p) در نظر گرفته شده است. Week: هفته. *: تفاوت معنی‌دار





شکل 4: بیان پروتئین NCAM تارهای عضله نعلی در رده‌های سنی مختلف
 
بحث
عضلات و عملکرد فیزیولوژیکی آن از لحاظ کمی و کیفی در مراحل مختلف زندگی دستخوش تغییرات زیادی می‌شود. که این تغییرات با توجه به فرایند رشد با افزایش سن، وضعیت سلامتی افراد و فعالیت بدنی متفاوت است (3). نتایج پژوهش حاضر نشان داد که پس از گذشت 6 هفته موش‌های صحرایی نر جوان افزایش معنی‌داری در هایپرتروفی عضلانی نسبت به موش‌های کودک از خود نشان دادند. این در حالیست که در رده سنی سالمند نسبت به هر دو رده کودک و جوان کاهش معنی‌دار در هایپرتروفی عضلانی مشاهده گردید. مطالعات نشان داده‌اند که عملکرد و توده عضلانی با افزایش سن تا دوره جوانی افزایش، سپس تا دوره سالمندی به‌طور ناهمگن کاهش می‌یابد (18). در همین راستا نشان داده شده است که آتروفی عضلانی زودتر از آن که قبلاً شناخته شده بود یعنی سنین 50 تا 60 سالگی رخ می‌دهد (6). در خصوص افزایش تعداد تارهای عضلانی در پژوهش حاضر بین رده‌های کودک و جوان تفاوت معنی‌داری مشاهده نشد. اما در رده سالمند نسبت به دو رده کودک و جوان همانند هایپرتروفی عضلانی، کاهش چشمگیری در تعداد تارهای عضلانی مشاهده شد. بر اساس یافته‌های پیشین شواهد قطعی هایپرپلازی در بزرگسالان وجود ندارد (21-19). اما شواهد محدودی از هایپرپلازی در گسترش میوفیبرهای عضلانی نمونه‌های حیوانی گزارش شده است (22). از این‌رو نتایج پژوهش حاضر نشان داد که افزایش سن با افزایش معنی‌دار در بیان پروتئین sema3a عضله نعلی همراه می‌باشد. نتایج به‌دست آمده همسو با مطالعاتی است که نشان داده‌اند تخریب NMJ و نورون‌های حرکتی با پیری افزایش می‌یابد (23). Sema3a یک پروتئین دفع‌کننده عصب است که در وضعیت‌های مختلف از قبیل بیماری‌های تخریب‌کننده عصبی و آسیب‌های اعصاب محیطی، به‌ویژه در تارهای عضلانی تند انقباض باعث تخریب نورون های حرکتی می‌گردد (10). از دیگر یافته‌های پژوهش حاضر کاهش چشمگیر بیان پروتئین NCAM بر اثر فرایند رشد و افزایش سن بود. در همین راستا مطالعات پیشین نشان داده‌اند که افزایش سن،NCAM  را به میزان قابل توجهی کاهش می‌دهد (17). به همین جهت به نظر می‌رسد که کاهش پروتئین NCAM می‌تواند موجب نارسایی‌های عصبی عضلانی گردد (14).
نتیجه‌گیری
به طور‌کلی نتایج پژوهش حاضر نشان داد که بر اثر فرایند رشد از دوران کودکی به جوانی افزایش هایپرتروفی عضلانی اتفاق می‌افتد و این روند در گذر از جوانی به سالمندی به سمت منفی پیش رفته و کاهش هایپرتروفی اتفاق می افتد. با توجه به افزایش سن روند کاهشی در هایپرپلازی عضلانی اتفاق می‌افتد که این روند کاهشی در مرحله سالمندی قابل ملاحظه است. هم‌چنین پروتئین‌های درگیر در رشد آکسونی بر اثر رشد و افزایش سن از دوران کودکی به جوانی و سالمندی کاهش و پروتئینهای تخریب کننده اعصاب و نارساییهای عصبی، افزایش مییابد.
سپاس‌گزاری
نویسندگان این مقاله بر خود لازم می‌دانند از مدیریت و پرسنل محترم موسسه دانش‌بنیان بافت و ژنتیک پاسارگاد صمیمانه تشکر و قدردانی کنند. هم‌چنین مقاله حاضر برگرفته از پایان نامه دکتری دانشگاه آزاد اسلامی واحد رشت می‌باشد.
حامی مالی: ندارد.
تعارض در منافع: وجود ندارد.
 


 

References:
 
1-    Brinkmann AO. Molecular Mechanisms of Androgen Action–A Historical Perspective. Androgen Action 2011: 3-24.
2-    Kato H, Shibahara T, Rahman N, Takakura H, Ohira Y, Izawa T. Effect of a 9‐Week Exercise Training Regimen on Expression of Developmental Genes Related to Growth‐Dependent Fat Expansion in Juvenile Rats. Physiological Reports 2018; 6(19): E13880.
3-    Francaux M, Deldicque L. Exercise and the Control of Muscle Mass in Human. Pflügers Archiv-Eur J Physiol 2019; 471(3): 397-411.
4-    Sakuma K, Yamaguchi A. Sarcopenia and Age-Related Endocrine Function. International J Endocrinology 2012; 2012.
5-    Tesch P, Ekberg A, Lindquist D, Trieschmann J. Muscle Hypertrophy Following 5‐Week Resistance Training Using a Non‐Gravity‐Dependent Exercise System. Acta Physiologica Scandinavica 2004; 180(1): 89-98.
6-    Phillips BE, Williams JP, Greenhaff PL, Smith K, Atherton PJ. Physiological Adaptations to Resistance Exercise as a Function of Age. JCI Insight 2017; 2(17).
7-    Deschenes MR, Roby MA, Glass EK. Aging Influences Adaptations of the Neuromuscular Junction to Endurance Training. Neuroscience 2011; 190: 56-66.
8-    Bhasin S. Regulation of Body Composition by Androgens. Journal of Endocrinological Investigation 2003; 26(9): 814-22.
9-    Son Y-J, Thompson WJ. Nerve Sprouting in Muscle is Induced and Guided by Processes Extended by Schwann Cells. Neuron 1995; 14(1): 133-41.
10-    De Winter F, Vo T, Stam FJ, Wisman LA, Bär PR, Niclou SP, et al. The Expression of the Chemorepellent Semaphorin 3A is Selectively Induced in Terminal Schwann Cells of a Subset of Neuromuscular Synapses that Display Limited Anatomical Plasticity and Enhanced Vulnerability in Motor Neuron Disease. Molecular and Cellular Neuroscience 2006; 32(1-2): 102-17.
11-    Venkova K, Christov A, Kamaluddin Z, Kobalka P, Siddiqui S, Hensley K. Semaphorin 3A Signaling Through Neuropilin-1 is an Early Trigger for Distal Axonopathy in the SOD1G93A Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology 2014; 73(7): 702-13.
12-    Vo TT. Studies on Semaphorin 3A in ihe Neuromuscular Junction and in Perineuronal Nets: Vrije Universiteit; 2011.
13-    Franz CK, Rutishauser U, Rafuse VF. Intrinsic Neuronal Properties Control Selective Targeting o f Regenerating Motoneurons. Brain 2008; 131(6): 1492-505.
14-    Caldow MK, Thomas EE, Dale MJ, Tomkinson GR, Buckley JD, Cameron‐Smith D. Early Myogenic Responses to Acute Exercise Before and after Resistance Training in Young Men. Physiological Reports 2015; 3(9): E12511.
15-    Deschenes MR, Kressin KA, Garratt RN, Leathrum CM, Shaffrey EC. Effects of Exercise Training on Neuromuscular Junction Morphology and Pre-to Post-Synaptic Coupling in Young and Aged Rats. Neuroscience 2016; 316: 167-77.
16-    Ghadiri Hormati L, Aminaei M, Dakhili AB. The Effect of High-Intensity Exercise Training on Gene Expression of Semaphorin 3A in Extensor Digitorum Longus Muscles of Aged C57bl/6 Mice. Scientific J Ilam University of Medical Sciences 2017; 25(1): 92-102.[Persian]
17-    Tayebi SM, Siahkouhian M, Keshavarz M, Yousefi M. The Effects of High-Intensity Interval Training on Skeletal Muscle Morphological Changes and Denervation Gene Expression of Aged Rats. Montenegrin J Sports Science and Medicine 2019; 8(2): 39-45.
18-    Mitchell WK, Atherton PJ, Williams J, Larvin M, Lund JN, Narici M. Sarcopenia, Dynapenia, and the Impact of Advancing Age on Human Skeletal Muscle Size and Strength; A Quantitative Review. Front in Physiol 2012; 3: 260.
19-    Moro T, Brightwell CR, Deer RR, Graber TG, Galvan E, Fry CS, et al. Muscle Protein Anabolic Resistance to Essential Amino Acids Does Not Occur in Healthy Older Adults Before or after Resistance Exercise Training. J Nutr 2018; 148(6): 900-9.
20-    Bickel CS, Cross JM, Bamman MM. Exercise Dosing to Retain Resistance Training Adaptations in Young and Older Adults. Med Sci Sports Exerc 2011; 43(7): 1177-87.
21-    Stec MJ, Thalacker-Mercer A, Mayhew DL, Kelly NA, Tuggle SC, Merritt EK, et al. Randomized, Four-Arm, Dose-Response Clinical Trial to Optimize Resistance Exercise Training for Older Adults with Age-Related Muscle Atrophy. Exp Gerontol 2017; 99: 98-109.
22-    Raue U, Trappe TA, Estrem ST, Qian H-R, Helvering LM, Smith RC, et al. Transcriptome Signature of Resistance Exercise Adaptations: Mixed Muscle and Fiber Type Specific Profiles in Young and Old Adults. J Appl Physiol  2012; 112(10): 1625-36.
23-    Gonzalez-Freire M, De Cabo R, Studenski SA, Ferrucci L. The Neuromuscular Junction: Aging at the Crossroad Between Nerves and Muscle. Front in Aging Neurosci 2014; 6: 208.