ماهنامه علمی پ‍ژوهشی

مقدمه
یکی از مشکلات اساسی همراه با بیماری‌های مختلف درد و التهاب می‌باشد. التهاب یک نوع پاسخ دفاعی بدن است که در اثر آسیب بافتی، عوامل شیمیایی و میکروبی ایجاد می‌شود. در این واکنش واسطه‌های التهابی مختلفی مانند پروستاگلاندین‌ها که واسطه‌های اصلی در التهاب، درد و افزایش دمای بدن هستند آزاد می‌شوند‌. آنزیم‌های سیکلواکسیژناز (COX) انزیم کلیدی در تبدیل آراشیدونیک اسید به پروستاگلاندین‌ها هستند (3-1). سیکلو‌اکسیژناز یک پروتئین داخل غشایی گلیکوزیله و یک هومودیمر می‌باشد. این آنزیم از طریق سطح هیدروفوبیک هلیکس‌های آمفی‌پاتیک در یک لایه از غشای فسفولیپید قرار می‌گیرد. آنزیم با استفاده از تیروزین 385 دو اکسیژن رادیکالی را به آراشیدونیک اسید انتقال می‌دهد تا واسطه‌های التهابی از آن ساخته شود. از طرفی اکسیژن‌های موجود در آراشیدونیک اسید با آرژنین 120 که در مجاورت کانال هیدروفوب وجود دارد پیوند برقرار می‌کنند و آراشیدونیک اسید به درون جایگاه فعال آنزیم وارد می‌شود‌. مطالعات نشان داده است که آرژینین 120‌، تیروزین 385 و سرین 530 اسید آمینه‌های ضروری در ساختار آنزیم سیکلو‌اکسیژناز هستند. در پستانداران دو ایزوفرم از این آنزیم به نام‌های سیکلو‌اکسیژناز 1و 2 وجود دارد که ژن‌های مستقل و الگوی بیان متفاوت دارند. دو ایزو‌آنزیم از لحاظ اندازه توالی اسیدهای آمینه تا حدود زیادی مشابهند ولی از نظر الگوی بیان و عملکرد سلولی متفاوتند (7-4). ایزو آنزیم 1 مسئول تشکیل واسطه‌های بیولوژیکی مهم مانند پرو‌ستانوئیدها (پرو‌ستاگلاندین‌ها، پروستا سایکلین‌ها‌، ترومبوکساین‌) و هم‌چنین موکوس در لوله گوارش است برای همین مصرف مهارکنندگان این ایزو آنزیم به‌عنوان دارو سبب تحریک لوله گوارش خواهد شد. سیکلواکسیژناز 2 در دردهای التهابی دخیل است و نقش مهمی در بیوسنتز پروستاگلاندین در سلول‌های التهابی دارد (2). داروهای ضد التهاب غیر‌استروئیدی از طریق مهار ایزو‌آنزیم 1 یا مهار هر دو ایزو‌آنزیم عمل می‌کنند. مهارکنندگان این ایزوآنزیم‌ها می‌توانند در کنترل و بهبود التهاب موثر باشند (10-8). ایساتین یا (Indole-1H-2,3-dione) (شکل1) یک ترکیب هتروسیکل و مشتق ایندول شامل گروه‌های کتو (در موقعیت 2 و 3 حلقه) لاکتام می‌باشد این ماده یک ترکیب طبیعی و تنظیم‌کننده بیولوژیک اندوژن است که در مغز بافت‌های محیطی و مایعات بدن یافت می‌شود. مشتقات ایساتین به دلیل فعالیت‌های قوی بیولوژیکی و دارویی مورد توجه علم شیمی دارویی قرار گرفته‌اند (2). از خواص بیولوژیک آن‌ها می‌توان به خواص ضد سرطان (12،11)، ضد میکروبی (16-13)، ضد التهاب، ضد درد (2)، وضد تشنج (17) اشاره کرد. گزارشاتی مبنی از مهار آنزیم‌های سیکلو اکسیژناز توسط مشتقات ایساتین وجود دارد (11). جاراپولا و همکارانش در مطالعه‌ای مشتقات بنزوهیدرازید – ایساتین را از نظر برهمکنش با آنزیم‌های سیکلو اکسیژناز 1و 2 به‌وسیله داکینگ مولکولی مورد بررسی قرار دادند که بین نتایج تئوری و in-vivo ارتباط قابل توجهی مشاهده شد (2). مشتقات شیف-باز و مانیش باز از ایساتین خواص ضد میکروبی و التهاب نشان داده‌اند (21-17). مطالعه رابطه ساختار- فعالیت مشتقات ایساتین نشان داده است که استخلاف زنجیری الکیل با حداکثر 2 اتم کربن در موقعیت 1 باعث افزایش فعالیت بیولوژیک ترکیبات می‌شود (22). هم‌چنین در مطالعات دیده شده است که طبیعت استخلاف در موقعیت3 حلقه ایندولی نقش مهمی در تنظیم خواص ضد التهاب دارد (23). داکینگ مولکولی پیش‌بینی ساختار پیچیده لیگاند –رسپتور با استفاده از روش محاسبه است در این روش مولکول‌های کوچک درون جایگاه فعال ماکرومولکول‌های هدف داک شده و به اتصال آن‌ها در این جایگاه امتیاز داده می‌شود (24). در این مطالعه تعدادی از مشتقات سنتز شده ایساتین که اثرات ضد التهابی در آزمایشات برون تن نشان داده‌اند ( شکل 2) (23) از نظر چگونگی برهمکنش با آنزیم‌های سیکلو‌اکسیژناز به روش داکینگ مولکول مورد بررسی قرار گرفتند (شکل‌های4 و3)‌. هم‌چنین خواص فارماکوکینتیک و پیروی از قانون لیپینسکی این مشتقات ارزیابی شد. امید است تا از تطابق نتایج عملی با تئوری بتوان مکانیسم احتمالی را برای این مشتقات پیشنهاد داد. نتایج به‌دست آمده از مطالعات داکینگ و خواص فارماکوکینتیک بتواند در طراحی ترکیبات موثرتر در آینده مفید واقع شود.
 
روش بررسی
آماده‌سازی پروتئین
ساختار کریستالوگرافی سیکلو‌اکسیژناز1 (PDB Id:3KK6)با قدرت تفکیک 2/75 انگستروم و سیکلو‌اکسیژناز 2 (PDB Id:3LN1) با قدرت تفکیک 2/4 انگستروم از بانک اطلاعات پروتئین دانلود گردید. سلکوکسیب به‌عنوان لیگاند کوکریستال به همراه مولکول‌های آب‌، (بتا اکتیل گلوکوزید BOG)و-N) استیل-D گلوکز آمین(NAG در ساختار به‌طور همزمان حذف شدند‌. ساختار با استفاده از برنامه اتوداک تولز پروتونه شد و بعد از تعیین بار و تهیه فایل PDBQT برای مطالعه داکینگ استفاده شدند.
آماده‌سازی لیگاند
تعدادی از مشتقات جدید سنتز شده ایساتین توسط همین گروه تحقیقاتی که در آزمایشات برون تن به روش ادم گوش القا شده با کروتون اثرات ضد التهابی نشان داده‌اند (I1-I4 ) در این مطالعه استفاده شدند (‌2) (23) ساختار ترکیبات با استفاده از نرم افزارهیپرکم (hyperchem ) ترسیم شد و با استفاده از روش نیمه تجربی PM3 بهینه‌سازی شدند. بعداز تعیین بار و مشخص کردن چرخش زاویه‌ای با استفاده از برنامه اتوداک تولز فایل PDBQT لیگاندها برای داکینگ مورد استفاده قرار گرفتند.
داکینگ مولکولی
برای بررسی بر هم‌کنش لیگاندها با آنزیم‌های سیکلواکسیژناز از نرم افزار اتوداک (Auto Dock 1.5.6‌) استفاده شد. جعبه گرید با ابعاد 60×60×60 برای هر دو آنزیم در نظر گرفته شد. با توجه به موقعیت سلکوکسیب در ساختار کریستالوگرافی برای سیکلو‌اکسیژناز نوع 2 ابعادy (-21.18) z (-15.92) x (30.82) و برای ایزو آنزیم سیکلو‌اکسیژناز نوع 1 ابعاد
x (-32.41) y (43.37)z (-5.54) انتخاب شد .پارامترهای شبکه و داکینگ مطابق با پارامترهای پیش فرض برنامه تنظیم شد. پس از انجام داکینگ بهترین کنفورماسیون با پایین‌ترین میزان انرژی اتصال به عنوان نتیجه انتخاب شد. فایل‌های نتایج به‌دست آمده با استفاده از برنامه Accelrys Discovery Studio Visualizer 4  مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. با اتصال مجدد سلکوکسیب به عنوان یک مهارکننده کوکریستالیزه به آنزیم‌های مربوطه با (RMSD) root mean square deviation زیر 1 آنگستروم پروسه داکینگ مولکولی اعتبار سنجی شد. انرژی آزاد اتصال (ΔG)، ثابت مهار (Ki) و برهمکنش پیوند هیدروژنی که از مطالعات داکینگ با استفاده از اتوداک به‌دست آمده است در جدول 1 و شکل‌های 3و4 ارائه شده است.
تخمین پارامترهای فارماکوکینتیک با استفاده از Swiss ADME  
قانون لیپینسکی (‌Lipinski’s “rule of five) شامل وزن مولکولی ترکیب ‌(MW)، تعداد اتم‌های ‌دهنده باند هیدروژنی(NHBD) ، تعداد اتم‌های پذیرنده باند هیدروژنی(NHBA)  و (log P) برای ارزیابی اینکه ترکیب جدید می‌تواند خواص دارو داشته باشد به‌کار می‌رود‌. امروزه چندین برنامه آنلاین در دسترس است که در پیش‌بینی خواص فارماکوکینتیک کاندیدای دارویی کمک می‌کند‌. پیش‌بینی خواص فارماکوکینتیک برای مشتقات ایساتین با استفاده از( SwissADME website) انجام شد (25).
تجزیه و تحلیل آماری
در این مطالعه برهم‌کنش بین ترکیبات سنتز شده و آنزیم سیکلو‌اکسیژناز 1 و 2 به کمک داکینگ ارزیابی شد.
ملاحظات اخلاقی
پروپوزال این تحقیق توسط دانشگاه علوم پزشکی اصفهان.تایید شده است (کد‌اخلاق. (IR.MUI.RESEARCH.REC.1397.145)
نتایج
انرژی آزاد اتصال (ΔG)‌، ثابت مهار (Ki) و برهمکنش پیوند هیدروژنی که از مطالعات داکینگ با استفاده از اتوداک به‌دست آمده است در جدول1 و شکل‌های 3و4 ارائه شده است. ترکیبات I2و  I3  کمترین مقادیر را در اتصال به هردو فرم از آنزیم سیکلواکسیژناز نشان دادند. هرچه مقدار انرژی کمتر باشد تمایل لیگاند به جایگاه اتصال بیشتر می‌باشد و ثابت مهار برای این دو ترکیب‌، به‌ویژه ترکیب I3 در محدوده نانو مولار برای هردو فرم از آنزیم می‌باشد‌. اسید‌امینه‌های لوسین 338 و سرین 516 از آنزیم سیکلو‌اکسیژناز 2 به‌ترتیب با گروه کربونیل حلقه ایساتین ترکیبI2  و گروه کربونیل پیوند آمیدی ترکیب I3  باند هیدروژنی شکل می‌دهند. اسید امینه‌های پرولین 191، سرین516، آسپارژین 515 و هیستیدین 90 از سیکلو اکسیژناز 1 با ترکیب I2 وگلوتامین 524 و آرژینین 120 از این ایزو آنزیم به ترتیب با آمین و گروه کربونیل حلقه ایساتین از ترکیب I3 در شکل‌گیری باندهای هیدروژنی سهیم هستند. انرژی اتصال ترکیب I4 با سیکلواکسیژناز 2 و1 به ترتیب 6/73- و 6/06-کیلوکالری بر مول بوده و ثابت مهار آن نیز برای هر دو فرم از آنزیم در محدوده میکرومولار است. سرین 516‌، تیروزین 371 از آنزیم سیکلواکسیژناز 2 با قسمت مانیش –باز ترکیب برهمکنش به صورت پیوند هیدروژنی داشتند وهیستیدین 90 و ترئونین 94 از آنزیم سیکلواکسیژناز1 به ترتیب با گروه کربونیل حلقه ایساتین و گروه مانیش-باز ترکیب پیوند هیدروژنی تشکیل دادند (شکل 3و4) ترکیب I1  در مطالعه تجربی (اثر ضد التهاب) و تئوری (از نظر تداخلات با آنزیم‌ها) اثرات بارزی نشان نداد. نتایج حاصل از پیش بینی خواص برای مشتقات ایساتین با استفاده از SwissADME website در جدول 2 نشان داده شده است. مطابق با پارامترهای جدول2 ترکیبات مطالعه شده همگی از قانون 5 لیپینسکی پیروی می‌کنند.  
 

شکل1: ساختار ایساتین


شکل2: ساختار مشتقات ایساتین مورد استفاده در بررسی داکینگ مولکولی (23)

جدول1: مقادیر انرژی اتصال)کیلوکالری/مول)‌، تداخلات هیدروژنی با جایگاه فعال، ثابت مهار(Ki)  مشتقات جدید ایساتین با آنزیم‌های سیکلواکسیژناز1و2 محاسبه شده توسط اتوداک




شکل3: بر‌همکنش احتمالی مشتقات ایساتین با آنزیم سیکلو اکسیژناز2. (الف) ترکیبI2و (ب) ترکیب I3(ج) ترکیب I4

شکل4: بر همکنش ا‌حتمالی مشتقات ایساتین با آنزیم سیکلو اکسیژناز1.(الف) ترکیبI2 و(ب) ترکیب I3 (ج) ترکیب I4


جدول 2: تخمین پارامترهای فارماکوکینتیک مشتقات ایساتین با استفاده از(SwissADME website) 

1Octanol–water partition coefficient
2Number of hydrogen-bond donors (OH and NH groups)
3Number of hydrogen-bond acceptors (O and N atoms)
4topological polar surface area
 
بحث
مشتقات ایساتین خواص بیولوژیکی متفاوتی نشان داده‌اند (17-14) که یکی از مهم‌ترین آن اثر ضد التهاب می‌باشد که به‌ویژه از مشتقات ایساتین با گروه‌های شیف- باز و مانیش باز مشاهده شده است (26،20)‌. مشتقاتی از ایساتین سنتز شدند و از نظر خواص ضد التهاب با روشcroton oil-induced ear edema. مورد بررسی قرار گرفتند این ترکیبات در دو دوز mg/kg 200 و 400 موردآزمایش  قرار گرفتند که ترکیب (**P<0.01)  I2  وترکیبI3,  (*** P<0.001) ( در مقایسه با کنترل (نرمال سالین) نشان دادند. ترکیب I1 در این دو دوز تفاوت معناداری با گروه کنترل در تست تجربی نشان نداد ترکیب I4 با توجه به اسکرین اولیه در تست ضد التهاب در دوز پایین تر100و200mg/kg مورد بررسی قرار گرفت که اثر ضد التهابی قوی با ***P<0.001)) داشت (23) در این مطالعه برهمکنش مشتقات ایساتین با آنزیم‌های سیکلواکسیژناز 1و 2 توسط برنامه داکینگ مورد ارزیابی قرار گرفت. همانطور که مقادیر انرژی اتصال برحسب کیلوکالری بر مول در جدول 1 نشان می‌دهد ترکیبات I2 و  I3  کمترین مقادیر را در اتصال به هر دو فرم از آنزیم سیکلواکسیژناز نشان دادند. ثابت مهار برای این دو ترکیب‌، به‌ویژه ترکیب I3 در محدوده نانومولار برای هر دو فرم از آنزیم می‌باشد‌. در مطالعات ضد التهاب برون تن این دو ترکیب تفاوت معناداری با گروه کنترل نشان دادند (23). که در تطابق با مطالعات داکینگ می‌باشد و می‌تواند تا حدودی تاییدی بر مکانیسم ضد التهابی این ترکیبات از طریق مهار این آنزیم باشد که البته مطالعات مهار آنزیم توسط این مشتقات از طریق کیت‌های تشخیصی نیز برای تایید لازم می‌باشد‌. انرژی اتصال ترکیب I4 که فقط حاوی گروه مانیش باز بوده و در مطالعات برون تن به‌عنوان قویترین ترکیب شناخته شده بود با سیکلواکسیژناز 2 و 1 به ترتیب 6/73- و 6/06-کیلوکالری بر مول بوده و ثابت مهار آن نیز بر ای هر دو فرم از آنزیم در محدوده میکرومولار است که می‌توان به فقدان گره شیف-باز در این ترکیب نسبت داد یا اینکه اثرات ضد التهابی این ترکیب ممکن است از مسیرهای دیگری غیر از مهار آنزیم‌های سیکلو اکسیژناز باشد. با مقایسه نتایج تئوری و تجربی در این تحقیق می‌توان  فهمید که از روش تئوری داکینگ تنها می‌توان به‌عنوان ابزاری برای تعیین مکانیسم احتمالی ترکیبات استفاده کرد که برای تایید بیشتر مطالعات مهار آنزیمی به‌صورت تجربی حتماً توصیه می‌شود. نکته دیگر اینکه اگر ترکیبی از روشی غیر از تاثیر بر رسپتور یا آنزیم اثر داشته باشد ممکن است در مطالعات داکینگ و تجربی تناقض دیده شود چناچه در مورد ترکیب I4 در این مطالعه دیده شد. جاراپولا و همکارانش در مطالعه‌ای مشتقات بنزوهیدرازید –ایساتین را از نظر برهمکنش با آنزیم‌های سیکلو اکسیژناز 1و 2 به‌وسیله داکینگ مولکولی مورد بررسی قرار دادند که بین نتایج تئوری و in-vivo ارتباط  قابل‌توجهی مشاهده شد و در مطالعه توسط آن‌ها نیز مانند طرح حاضر گروه کربونیل حلقه ایساتین و گروه کربونیل پیوند آمیدی با اسیدهای آمینه آنزیم تداخلات هیدروژنی نشان دادند (2). در مطالعات خواص فارماکوکینتیک، مقادیر نواحی سطح قطبی توپولوژیکال (TPSA) یک فاکتور مهم برای پیش‌بینی استفاده خوراکی دارو می‌باشدکه از نواحی سطحی همه اتم‌های قطبی مانند اکسیژن‌، نیتروژن و هیدروژن‌های متصل شده به آن‌ها به‌دست می‌آید. اگر ترکیبی مقدار (TPSA) کمتر از 140 انگستروم دارد این ترکیب باید نفوذپذیری روده‌ای مناسبی داشته باشد و( TPSA) کمتر از 60 انگستروم نفوذپذیری خوبی از سد خونی- مغزی دارد (27)که مطابق با جدول 2 تمام ترکیبات نفوذ پذیری گوارشی بالایی داشتند. لیپوفیلیسیتی یک مولکول فاکتور فیزیکو-شیمیایی مهم برای تخمین انتشار غیر فعال ترکیب از طریق غشای روده می‌باشد که به‌عنوانlogP شناخته می‌شود که تمام ترکیبات مقادیر کمتر از 5 نشان دادندکه نشان‌دهنده لیپوفیلیسیته مناسب برای جذب روده‌ای است. توانایی تشکیل باند هیدروژنی پارامتر دیگری برای نفوذپذیری دارو است.که برای جذب ایده آل تعداددهنده باند هیدروژنی و پذیرنده باند هیدروژنی باید به ترتیب کمتر از 5 و 10 باشد. زیست دستیابی خوراکی مناسب هم‌چنین متاثر از تعداد باندهای قابل چرخش می‌باشد که باید کمتر از 10 باشد (28). مطابق با پارامترهای جدول 2 ترکیبات مطالعه شده همگی از قانون 5 لیپینسکی پیروی می‌کنند.
نتیجه‌گیری
ترکیبات I2و I3  در مطالعات ضد التهاب برون‌تن تفاوت معناداری با گروه کنترل نشان دادندکه در تطابق با مطالعات داکینگ می‌باشد و می‌تواند تاییدی بر مکانیسم احتمالی این ترکیبات از طریق مهار این آنزیم باشد. مطالعات مهار آنزیم توسط این مشتقات از طریق کیت‌های تشخیصی نیز برای تایید بیشتر لازم می‌باشد. با توجه به نتایج حاصل از داکینگ، تداخلات گروه‌های عاملی با اسیدهای‌ آمینه آنزیم، نتایج تجربی و فارماکوکینتیک امید است این تحقیق بتواند در طراحی ترکیبات موثرتر در آینده مفید واقع شود.
سپاس‌گزاری
این مقاله منتج از پایان‌نامه داروسازی دکترای عمومی به شماره طرح 397132 در دانشگاه علوم پزشکی اصفهان است.
حامی مالی: ندارد.
تعارض در منافع: ندارد.
 

References:
 
1-    Szczukowski Ł, Krzyżak E, Zborowska A, Zając P, Potyrak K, Peregrym K, et al. Design, Synthesis and Comprehensive Investigations of Pyrrolo [3, 4-d] pyridazinone-Based 1, 3, 4-Oxadiazole as New Class of Selective COX-2 Inhibitors. Intl J Mol sci 2020; 21(24): 9623.
2-    Jarapula R, Gangarapu K, Manda S, Rekulapally S. Synthesis, in Vivo Anti-Inflammatory Activity, and Molecular Docking Studies of New Isatin Derivatives. Int J Med Chem 2016; 2016: 1-9.
3-    Babu GS, Rajani N, Malathy PS, Srinivas B, Kulandaivelu U, Rao JV. Synthesis, Characterization and Evaluation of Novel N-(1H-Benzimidazol-2-Yl)-2-Isatinylidene-Hydrazinecarboxamide Derivatives as Anti-Inflammatory Agents. Der Pharma Chemica 2010; 2(3): 196-204.
4-    Rouzer CA, Marnett LJ. Cyclooxygenases: Structural and Functional Insights. J Lipid Res 2009; 50 (Suppl): S29-34.
5-    Rieke CJ, Mulichak AM, Garavito RM, Smith WL. The Role of Arginine 120 of Human Prostaglandin Endoperoxide H Synthase-2 in the Interaction with Fatty Acid Substrates and Inhibitors. J Biol Chem 1999; 274(24): 17109-14.
6-    Rowlinson SW, Kiefer JR, Prusakiewicz JJ, Pawlitz JL, Kozak KR, Kalgutkar AS, et al. A Novel Mechanism of Cyclooxygenase-2 Inhibition Involving Interactions with Ser-530 and Tyr-385. J  Biol Chem 2003; 278(46): 45763-9.
7-    Arora M, Choudhary S, Singh PK, Sapra B, Silakari O. Structural Investigation on the Selective COX-2 Inhibitors Mediated Cardiotoxicity: A Review. Life Sci 2020; 251: 117631.
8-    Eren G, Ünlü S, Nuñez MT, Labeaga L, Ledo F, Entrena A, et al. Synthesis, Biological Evaluation, and Docking Studies of Novel Heterocyclic Diaryl Compounds as Selective COX-2 Inhibitors. Bioorg Med Chemistry 2010; 18(17): 6367-76.
9-    Consalvi S, Alfonso S, Di Capua A, Poce G, Pirolli A, Sabatino M, et al. Synthesis, Biological Evaluation and Docking Analysis of A New Series of Methylsulfonyl and Sulfamoyl Acetamides And Ethyl Acetates as Potent COX-2 Inhibitors. Bioorg Med Chem 2015; 23(4): 810-20.
10-    Firke SD, Bari SB. Synthesis, Biological Evaluation and Docking Study of Maleimide Derivatives Bearing Benzenesulfonamide as Selective COX-2 Inhibitors and Anti-Inflammatory Agents. Bioorg Med Chem 2015 ; 23(17): 5273-81.
11-    Khan FA, Maalik A. Advances in Pharmacology of Isatin and its Derivatives: A Review. Trop J Pharm Res 2015; 14(10): 1937-42.
12-    Solomon VR, Hu C, Lee H. Hybrid Pharmacophore Design and Synthesis of Isatin–Benzothiazole Analogs for their Anti-Breast Cancer Activity. Bioorg Med Chem 2009; 17(21): 7585-92.
13-    Kumar NS, Pradeep T, Jani G, Silpa D, Vijaya Kumar B. Design, Synthesis, and Antimicrobial Screening of Novel Pyridyl-2-Amidrazone Incorporated Isatin Mannich Bases. J Adv Pharm Technol Res 2012; 3(1): 57-61.
14-    El-Faham A, Hozzein WN, Wadaan MAM, Khattab SN, Ghabbour HA, Fun HK, et al. Microwave Synthesis, Characterization and Antimicrobial Activity of Some Novel Isatin Derivatiyes. J Chemistry 2015: 1-8.
15-    Patel A, Bari S, Talele G, Patel J, Sarangapani M. Synthesis and Antimicrobial Activity of Some New Isatinderivatives. Iranian J Pharmaceutical Research 2006; 5(4): 249-54.
16-    Selvam P, Murgesh N, Chandramohan M, De Clercq E, Keyaerts E, Vijgen L, et al. In Vitro Antiviral Activity of some Novel Isatin Derivatives against HCV and Sars-CoV Viruses. Indian J Pharm Sci 2008; 70(1): 91-4.
17-    Eggadi V, Kulandaivelu U, Sharvanabhava BS, Jupally VR. Screening of the Anticonvulsant Activity of some Isatin Derivatives in Experimental Seizure Models and its Effect on Brain GABA Levels in Mice. American J Pharmacological Sciences 2013; 1(3): 42-6.
18-    Panneerselvam P, Reddy RS, Murali K, Kumar NR. Synthesis, Analgesic, Anti-Inflammatory and Antimicrobial Activities of some Novel Schiff’s Bases of 5-Subsituted Isatin. Der Pharma Chemica 2010; 2(1): 28-37.
19-    Sharma PK, Balwani S, Mathur D, Malhotra S, Singh BK, Prasad AK, et al. Synthesis and Anti-Inflammatory Activity Evaluation of Novel Triazolyl-Isatin Hybrids. J Enzyme Inhib Med Chem 2016; 31(6): 1520-6.
20-    Sridhar SK, Saravanan M, Ramesh A. Synthesis and Antibacterial Screening of Hydrazones, Schiff and Mannich Bases of Isatin Derivatives. Eur J Med Chem 2001; 36(7-8): 615-25.
21-    Tehrani KHME, Hashemi M, Hassan M, Kobarfard F, Mohebbi S. Synthesis and Antibacterial Activity of Schiff Bases of 5-Substituted Isatins. Chin Chem Lett 2016; 27(2): 221-25.
22-    Ram VJ, Mishra L, Pandey HN, Vlietinck AJ. Pesticidalmannich Bases Derived from Isatinimines. J Heterocyclic Chemistry 1986; 23(5): 1367-69.
23-    Hassanzadeh F, Jafari E, Khayambashi N, Hajhashemi V. Synthesis and Anti-Inflammatory Effects Evaluation of 1,3 Substituted Isatin Derivatives. Thai J Pharm Sci 2021; 45 (4): 248-52.
24-    Hassanzadeh F, Jafari E, Zarabi M, Khodarahmi G, Vaseghi G. Synthesis, Cytotoxic Evaluation, and Molecular Docking Studies of some New 1, 3, 4-Oxadiazole-Based Compounds. Res Pharm Sci 2020; 15(5): 454-62.
25-    Jafari E , Taghi jarah-Najafabadi N, Jahanian-Najafabadi A, Poorirani S,  Hassanzadeh F, Sadeghian-Rizi S. Synthesis and Evaluation of Antimicrobial Activity of Cyclic Imides Derived from Phthalic and Succinic Anhydrides. Res Pharm Sci 2017; 12(6): 526-34.
26-    Roman G. Mannich Bases in Medicinal Chemistry and Drug Design. Eur J Med Chem 2015; 89: 743-816.
27-    Ertl P, Rohde B, Selzer P. Fast Calculation of Molecular Polar Surface Area as a Sum of Fragment-Based Contributions and its Application to the Prediction of Drug Transport Properties. J Med Chem 2000; 43(20) : 3714-7.
28-    Rafiee Pour Z, Nazifi SMR, Afshari Safavi A, Nazifi ZS, Massah AR. Solvent-Free Synthesis, ADME Prediction, and Evaluation of Antibacterial Activity of Novel Sulfonamide Derivatives. Russ J Org Chem 2019; 55: 852-9.