ماهنامه علمی پ‍ژوهشی

مقدمه
مالتیپل اسکلروزیس (MS) یک بیماری التهابی است که در آن غلاف‌های میلین سلول‌های عصبی در مغز و نخاع آسیب می‌بیند (2،1). شیوع مالتیپل اسکلروزیس در ایران در سال‌های اخیر رو به افزایش گزارش شده است (3). اینترفرون بتا یکی از داروهای اصلی و سودمند در درمان بیماری MS می‌باشد اما این دارو در 20 تا 50 درصد از موارد نتیجه‌ای نشان نداده است. مشخص کردن اینکه بیمار به این دارو جواب می‌دهد یا نه قبل از تجویز بسیار سودمند خواهد بود (4). متاسفانه مشاهده پاسخ بیمار به اینترفرون بتا، به پیگیری علائم بیمار به مدت 1 تا 2 سال نیاز دارد و این در بیماران غیر پاسخگو به این معناست که بیمار به مدت طولانی بدون درمان مفید باقی می‌ماند که فارغ از بی‌تاثیر بودن درمان، هزینه‌های زیادی به بیمار تحمیل خواهد شد. بسیاری از تفاوت‌های پاسخ به درمان به علت تنوع ژنتیکی بین افراد است. این جمله به این معنا است که افراد نیازمند دوز متفاوتی از یک دارو هستند و در موارد دیگر، داروهایی که برای یک فرد موثر و ایمن است، ممکن است برای دیگری کشنده باشد (6،5). بنابراین یافتن بیومارکرهایی جهت پیش‌‌بینی پاسخ به درمان در کنار یافته‌های بالینی و رادیولوژیکی برای مشخص کردن درمان صحیح و به موقع بسیار مفید خواهد بود. مطالعات زیادی نشان داده که سطح سرمی ویتامین D در بیماران MS به‌طور قابل‌ملاحظه‌ای پایین بوده است (7). ویتامین Dرا به عنوان یک فاکتور محیطی به‌طور قابل‌ملاحظه‌ای مسبب بروز بیماری‌های نورودژنراتیو مثل MS می‌دانند. فرم فعال ویتامین D عملکرد خود را از طریق اتصال به رسپتور ویتامینD هسته‌ای اعمال می‌کند. بنابراین نقص در این ژن باعث اختلال در عملکرد ویتامینD و در ادامه افزایش خطر بیماری‌های اتوایمن مثل MS می‌شود. پلی‌مورفیسم‌ها می‌توانند عملکرد رسپتور ویتامین D را تغییر دهند. 4 پلی‌مورفیسم در رسپتور ویتامین D را مرتبط با بیماری MS دانسته‌اند:FokIrs10735810, BsmIrs1544410 ,TaqI rs73123 و ApaIrs7975232 (9،8،5). در سال‌های اخیر مطالعات بسیاری در نقاط مختلف دنیا بر روی پلی‌مورفیسم‌های رسپتور ویتامین D و ارتباط آن‌ها با MS انجام گرفته است که نتایج آن‌ها متفاوت و بحث برانگیز است (10). از جمله این مطالعات، مطالعاتی است که بر روی جمعیت‌های ژاپن (11)، استرالیا (12)، اسلواکی (13)، کویت (14)، تونس (15)، ترکیه (16) و هم‌چنین ایران (18،17) انجام شده است. با توجه به اینکه این ژن می‌تواند نقش بسیار مهمی در بیماری MS ایجاد نماید و مورد توجه محققین بسیاری در سرتاسر جهان واقع شده و نتایج در جمعیت‌های مختلف دنیا بسیار متنوع گزارش شده است، هم‌چنین نتیجه بخشی متفاوت درمان با داروی اینترفرون بتا در بیماران، هدف این مطالعه جستجوی ارتباط بین 4 پلی‌مورفیسمFokI ,BsmI ,TaqI وApaI واقع در رسپتور ویتامین D در بیماران MS پاسخگو و غیر پاسخگو به درمان با اینترفرون بتا و هموار کردن راه جهت تجویز صحیح و سریع داروی مناسب به افراد هم‌چنین کاهش زمان، هزینه و عدم موفقیت در درمان است.
روش بررسی
نوع مطالعه مشاهده‌ای و روش مطالعه به صورت مورد-شاهدی است.
جمعیت مورد مطالعه: در این پژوهش 200 بیمار مبتلا به مالتیپل اسکروزیس که توسط متخصص نورولوژی بر اساس شاخص مک‌دونالد بیماریشان و نوع آن تایید شده بود، با رضایت شخصی خود شرکت کردند. (کد اخلاق: IR.SSU.MEDICINE.REC.1396.149) 100 فرد با متوسط سنی806 ± 36/39 گروه پاسخ‌دهنده به درمان و 100 فرد با متوسط سنی 7/25 ± 35/84 گروه غیر پاسخ دهنده به درمان را تشکیل می‌دهند. (آزمون آماری نشان داد که دو گروه از لحاظ سنی تفاوت معنی‌داری از خود نشان نمی‌دهند. (p=0/58). . بر اساس گزارشات موجود در مطالعات پیشین، بیمارانی که یک حمله یا بیشتر و افزایش 1 واحد EDSS در هر 6 ماه داشتند، در گروه غیرپاسخ‌دهنده به درمان (Non-responder,NR) و بیمارانی که کمتر از یک حمله یا کمتر از 1 واحد افزایش EDSS در هر 6 ماه داشتند، در گروه پاسخ‌دهنده به درمان (Responder,R) قرار گرفتند. بیماران همگی از نوع RRMS (relapsing-remitting MS) بوده و از داروهای بتا اینترفرون استفاده می‌کردند که هر یک حداقل در دو بازه زمانی 4 ماهه توسط متخصص از نظر وضعیت پلاک‌ها در MRI، وضعیت پیشرفت ناتوانی و مارکرهای خونی بررسی شده‌اند.
معیارهای ورود به مطالعه: ابتلا به بیماری MS - مصرف داروهای بتا اینترفرون
معیارهای خروج از مطالعه: ابتلا به سایر بیماری‌های اتوایمیون و بیماری‌های التهابی – مصرف سایر داروها
متغیرهای همسان سازی شده: سن - جنس
مراحل انجام مطالعه: از هر یک از افراد پاسخ دهنده و غیر پاسخ دهنده به درمان، پنج میلی‌لیتر خون محیطی با ضد انعقاد EDTA گرفته شد. با استفاده از کیت استخراج ستونی DNA ژنومی شرکت MBST ساخت ایران، DNA نمونه‌های خون استخراج شد. روش خالص‌سازی DNA در این کیت بر مبنای اتصال اختصاصی اسیدهای نوکلئیک به ستون شامل سیلیکا در حضور نمک‌های کائوتروپیک است. مواد غیر اسید نوکلئیک که توانایی اتصال به غشای ستون را داشتند طی مراحل مختلف شستشو و با سانتریفیوژ کردن از ستون شسته شدند. سپس DNA متصل به ستون با افزودن بافر حل‌کننده (Elution Buffer)، حل و جدا شده و پس از بررسی خلوص و کیفیت، تا زمان استفاده جهت انجام مراحل بعدی فریز گردید. در مرحله بعد واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR))، به‌وسیله دو آغازگر (پرایمر) الیگونوکلئوتیدی اختصاصی و مناسب انجام شد. پرایمرهای رفت و برگشت مورد استفاده، با نرم‌افزار Beacon طراحی شده و سپس صحت اتصال پرایمرها به توالی‌های مخصوص به خود و عدم اتصال آن‌ها به توالی‌های غیر‌مرتبط و مداخله‌گر در پایگاه NCBI nucleotide BLAST مورد تائید قرار گرفت و جهت سنتز به شرکت تکاپو زیست سفارش داده شد. پرایمرها به صورت لیوفیلیزه از شرکت تحویل و طبق پروتکل شرکت سازنده با آب مقطر فاقد DNase/RNase به غلظت 100 پیکومول بر میکرولیتر رسانده شد. تکثیر به کمک آنزیم Taq DNA polymerase و dNTPs توسط دستگاه ترموسایکلر ABI (دستگاهVeriti 96 Well Thermal Cycle شرکت Applied Biosystems (ABI) ساخت USA) در سه مرحله دمایی پشت سر هم، صورت گرفت. این عمل برای هر کدام از آنزیم‌ها به‌صورت جداگانه انجام شد و مواد مورد استفاده در میکس اپتیمایز شدند، سپس برای هر نمونه چهار واریانت PCR گذاشته شد. جهت بررسی اندازه قطعات تکثیر شده و اختصاصی بودن محصولات، الکتروفورز آن‌ها روی ژل آگارز انجام شد و محصولات بعد از اتمام واکنشPCR ، روی ژل آگارز 2 درصد الکتروفورز گردیدند. سپس از تکنیک PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) که یکی از روش‌های استاندارد در شناسایی پلی مورفیسم‌ها است، استفاده شد. برای این منظور محصول PCR را با آنزیم‌های محدود‌کننده طبق دستور شرکت سازنده با هم مخلوط کرده و با توجه به زمان برش آنزیم که در دستورالعمل آمده بهترین دما را برای برش انتخاب کردیم. بعد از زمان انکوباسیون محصول روی ژل آگارز 2 درصد الکتروفورز شد و با استفاده از الگوی به‌دست آمده از برش آنزیم‌های محدودگر، پلی مورفیسم‌های مختلف ژن های گیرنده ویتامین D مورد مطالعه در هر بیمار تفکیک و عکس ژل‌های الکتروفورز شده با دستگاه Gel documentation تهیه شد.
تجزیه و تحلیل آماری
در این مطالعه به منظور بررسی نرمال بودن داده‌ها از آزمون کولموگروف اسمیرنوف استفاده گردید، هم‌چنین دو گروه مورد مطالعه (‌پاسخ دهنده وغیر پاسخ دهنده به دارو) از نظر متغیر سن که تنها متغیر پارامتریک این مطالعه بود و جنس (متغیرناپارامتریک) مورد بررسی قرار گرفتند. به منظور بررسی اختلاف معنی‌دار ژنوتیپ‌ها در بین دو گروه از آزمون ناپارامتریک مربع کای استفاده گردید. نتایج به‌دست آمده با استفاده از نرم‌افزارSPSS version 16 ، با استفاده از روش آماری مربع کا   و با در نظر گرفتن مقدارP  کوچکتر از 0/05 به عنوان سطح معنی‌داری و محاسبه نسبت خطر نسبیOR) ) با فاصله اطمینان (CI) 95 درصد از طریق روش آماری رگرسیون لجستیک مورد آنالیز قرار گرفتند. قابل ذکر است به منظور تجزیه و تحلیل فراوانی آللی مربوط به هر پلی‌مورفیسم در افراد سالم و بیمار و سپس بین این دو گروه و مقایسه این مقادیر از نرم‌افزارSNP Analyzer نیز استفاده گردید. به منظور ترسیم گراف‌ها از نرم‌افزار Prism ورژن 5 استفاده شده است.
ملاحظات اخلاقی
پروپوزال این تحقیق توسط دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد تایید شده است (کد اخلاق IR.SSU.MEDICINE.REC.1396.149). 200 بیمار مبتلا به مالتیپل اسکروزیس با رضایت شخصی خود در مطالعه شرکت کردند. هم‌چنین این مطالعه مصوب کمیته اخلاق بوده و دارای کد اخلاق می‌باشد.
نتایج
مشاهده ژل بعد از الکتروفورز نشان‌دهنده تکثیر قطعه مورد انتظار بود. با مقایسه محصولات تکثیری مربوط به پلی مورفیسم‌ها با ladder می‌توان نتجه گرفت که اندازه محصول‌های PCR با اندازه‌های مورد انتظار همخوانی دارد. نتایج حاصل از هضم آنزیمی محصولاتPCR  در جداول 1 تا 4 آورده شده و تصویر باندهای حاصل از هضم آنزیمی مربوط به چهار پلی‌مورفیسم در چهار بیمار مختلف نیز در شکل 1 نشان داده شده ‌است.
نتایج آماری حاصل از بررسی ژنوتیپ‌ها و آلل‌ها در محل پلی‌مورفیسم‌ها
بررسی ژنوتیپ پلی‌مورفیسم ApaI: انجام تست آماری مربع کای‌سکوار حدود اطمینان p=0/68 را نشان داد و مشخص شد، رابطه آماری معنی‌داری بین هیچ کدام از ژنوتیپ‌ها و پاسخ یا عدم پاسخ به درمان وجود ندارد. در مطالعه حاضر، آنالیزهای آماری پلی‌مورفیسم ApaI هیچ افزایش خطر چشمگیری در ارتباط با ژنوتیپ AA و پاسخ و عدم پاسخ به درمان نشان نداد (OR=0/96، CI=%95، 0/61 – 1/50).  از طرف دیگر فراوانی آللA  و C  نیز با نرم‌افزار SPSS version 16 در گروه کنترل و بیمار محاسبه شد، با توجه به نتایج به‌دست آمده تفاوت معناداری در فراوانی اللی در دو گروه مشاهده نشد. همان‌طور که در جدول 5 مشاهده می‌شود نسبت شانس حدود 1 بوده و ژنوتیپ‌های مختلف شانس حدودا یکسانی در پاسخ و عدم پاسخ به درمان دارند.
بررسی آماری ژنوتیپ پلی‌مورفیسم BsmI: انجام تست آماری مربع کای- اسکوار حدود اطمینان p=0/65را نشان داد و مشخص شد، رابطه آماری معنی‌داری بین سه ژنوتیپ مختلف و پاسخ و عدم پاسخ به درمان بیماری وجود ندارد. در مطالعه حاضر، آنالیزهای آماری پلی‌مورفیسم BsamI هیچ افزایش خطر چشمگیری در بیماران با ژنوتیپ GG در مقایسه با گروه کنترل نشان نمی‌دهد (OR=0/88، CI=%95، 0/62 – 1/24).هم‌چنین با آنالیز نتایج فراوانی آلل‌ها مشخص گردید در این پلی مورفیسم نیز تفاوت معناداری بین الل¬های دو گروه پاسخ‌دهنده و غیرپاسخ‌دهنده وجود ندارد. همانطور که در جدول 6 مشاهده می‌شود نسبت شانس حدود 1 بوده و ژنوتیپ‌های مختلف شانس حدوداً یکسانی در پاسخ و عدم پاسخ به درمان دارند.
 بررسی آماری ژنوتیپ پلی‌مورفیسم FokI: انجام تست آماری مربع کای-اسکوار حدود اطمینان p=0/57 را نشان داد و مشخص شد، رابطه آماری معنی‌داری بین ژنوتیپ¬های حاصل و بیماری وجود ندارد هم‌چنین آنالیزهای آماری پلی‌مورفیسم FokI هیچ افزایش خطر چشمگیری در بیماران پاسخ‌دهنده به درمان و غیر پاسخ‌دهنده به درمان، از خود نشان نمی‌دهد (OR=0/86، CI=%95، 0/61 – 1/22). مقایسه فراوانی آللی پلی‌مورفیسم FokI بین دو گروه پاسخ دهنده و غیر پاسخ دهنده به درمان: فراوانی آلل‌T  و C  نیز در گروه کنترل و بیمار محاسبه شد. با توجه به نتایج به‌دست آمده تفاوت معناداری بین الل‌های دو گروه مشاهده نشد. همانطور که در جدول 7 مشاهده می‌شود نسبت شانس حدود 1 بوده و ژنوتیپ‌های مختلف شانس حدوداً یکسانی در پاسخ و عدم پاسخ به درمان دارند.
بررسی نتایج پلی مورفیسم TaqI: مقایسه پلی‌مورفیسم TaqI در بین دو گروه مورد مطالعه توسط تست مربع کای-اسکوار حدود اطمینان p=0/50 را نشان داد و مشخص شد، رابطه آماری معنی‌داری بین ژنوتیپ‌های حاصل و بیماری وجود ندارد. در مطالعه حاضر، آنالیزهای آماری پلی‌مورفیسم TaqI هیچ افزایش خطر چشمگیری در ژنوتیپ AA در دو گروه پاسخ‌دهنده به درمان و غیر پاسخ‌دهنده به درمان از خود نشان نداد (OR=0/84، CI=%95، 0/57 – 1/23).از طرف دیگر فراوانی آللA  وG نیز در گروه کنترل و بیمار آنالیز شد که با توجه به نتایج به‌دست آمده تفاوت معناداری بین الل‌های دو گروه مشاهده نشد. همانطور که در جدول 8 مشاهده می‌شود نسبت شانس حدود 1 بوده و ژنوتیپ‌های مختلف شانس حدوداً یکسانی در پاسخ و عدم پاسخ به درمان دارند.
 


جدول1: قطعات حاصل از هضم محصول  PCRپلی‌مورفیسم ApaI rs7975232 توسط آنزیمApa I



جدول 2: قطعات حاصل از هضم محصول  PCRپلی‌مورفیسم BsmI rs1544410 توسط آنزیمBsamI


جدول3: قطعات حاصل از هضم محصول  PCRپلی مورفیسم FokI rs10735810 توسط آنزیمFok I


جدول4: قطعات حاصل از هضم محصول  PCRپلی‌مورفیسم TaqI rs731236 توسط آنزیمTaq I











شکل 1: نتیجه الکتروفورز محصولات حاصل از برش آنزیم‌های محدود کننده

جدول5: محاسبه نسبت شانس پلی‌مورفیسم ApaI


جدول6: محاسبه نسبت شانس پلی مورفیسم  BsmI



جدول7: محاسبه نسبت شانس پلی‌مورفیسم FokI





جدول8: محاسبه شانس پلی‌مورفیسم TaqI







‌

تصویر 2: (A فراوانی ژنوتیپی FokI (B فراونی ژنوتیپی ApaI (C فراوانی ژنوتیپی TaqI (D فراوانی ژنوتیپی BsamI
 
بحث
سه پلی مورفیسم ApaI‌، TaqI و BsmI در ناحیه 3UTR و پلی مورفیسم FokI در اگزون 2 ژن VDR یا رسپتور ویتامین D واقع شده است (10). در این مطالعه با استفاده از تکنیکRestriction fragment Amplified Polymorphism (RFLP) به بررسی این پلی‌مورفیسم‌ها در افراد بیمار MS که شامل دو گروه پاسخ‌دهنده به درمان با اینترفرون بتا و عدم پاسخ‌دهنده به درمان با اینترفرون بتا در جمعیت مردم استان قزوین در خلال سال‌های 1395-1397 پرداخته شد. اکثر مطالعات پیشین به بررسی این پلی‌مورفیسم‌ها به‌صورت انفرادی، دو، سه و یا چهارتایی در بیماران MS و مقایسه آن با افراد کنترل پرداخته (19-11)، که دارای نتایج متفاوتی بوده‌اند، به‌طور مثال در مطالعه‌ای که بر روی جمعیت اسلواکی انجام شد، هیچ گونه ارتباطی بین پلی‌مورفیسم‌های ApaI و TaqI‌، با پیشرفت بیماری MS پیدا نشد (13)، در حالیکه مطالعه‌ای که در جمعیت مردم کویت صورت گرفت، نشان داد که واریانت ApaI با کاهش پیشرفت بیماری در ارتباط است و پلی‌مورفیسم TaqI با خطر ابتلا به MS ارتباط مستقیم دارد (14). این در حالی است که محققین در مطالعه بر روی بیماران تونسی به این نتیجه رسیدند که پلی‌مورفیسم در این دو واریانت باعث افزایش ابتلا به MS می‌شود (15). در مطالعه مربوط به اسلواکی مشخص شد که ژنوتایپ AA از BsmI خطر ابتلا به MS را کاهش می‌دهد (13) در صورتی‌که مطالعه بر روی مردم کویت نشان داد که BsmI با خطر ابتلا به MS ارتباط مستقیم دارد (14) اما یک مقاله مروری سیستماتیک بیان کرد که ارتباطی بین پلی‌مورفیسم BsmI و ابتلا به MS وجود ندارد. این مقاله بیان کرد که ژنوتایپ FF FokI فاکتور مهمی در خطر ابتلا به MS به حساب می‌آید (20). هم‌چنین مطالعه در جمعیت ترکیه یک ارتباط معنی‌داری بین پلی‌مورفیسم FokI و بیماری MS را نشان داد (16). اما در مطالعه‌ای در ایران در مورد پلی‌مورفیسم FokI ارتباط معناداری بین گروه بیمار و کنترل مشاهده نشد (18). در مطالعه دیگری که بر روی افراد سیسیلی صورت گرفت مشخص شد که پراکندگی ژنوتیپی و فراوانی آللی این 4 پلی‌مورفیسم تفاوت معنی‌داری در بین دو گروه بیمار و کنترل از خود نشان نمی‌دهد و به اشکال و دوره MS نامربوط می‌باشد (19). همانطور که شرح آن رفت در مطالعه حاضر هیچ گونه اختلاف معنی‌داری در فراوانی‌های ژنوتیپی و آللی در جمعیت افراد بیمار MS در بین دو گروه مشاهده نشد. از آن جهت که مطالعه‌ای مشابه با مطالعه حاضر وجود ندارد لذا قیاس مناسبی نیز نمی‌توان انجام داد زیرا بر خلاف مطالعات قبلی که به بررسی این پلی‌مورفیسم‌ها در بیماران MS در مقایسه با افراد کنترل پرداخته‌اند در مطالعه پیش رو هر دو گروه مطالعه شونده بیمار MS بوده و تفاوت آن‌ها پاسخ و عدم پاسخ به درمان با اینترفرون بتا می‌باشد. به هر حال نتایج بسیار ضد و نقیض در مطالعات گروه سالم و بیمار و مقایسه اختلافات در مطالعات پیشین می‌‌تواند ناشی از مسائل مختلفی همانند اندازه و حجم نمونه، جمعیت مورد مطالعه و خطای اندازه‌گیری و ... باشد. با توجه به شرایط بالینی بیماران MS و محدودیت‌ها و شرایط مختلف مانند نوع داروی مصرفی، عدم وجود پرونده پزشکی کامل و هم‌چنین محدودیت بودجه و زمان، دسترسی به تعداد بالای این بیماران کاری دشوار است. بنابراین در مطالعه حاضر امکان مطالعه بر روی تعداد بیشتری از بیماران وجود نداشت لذا پیشنهاد می‌شود که در مطالعات آینده حجم نمونه بالا و مناسب جهت بررسی بهتر مورد استفاده قرار گیرد.
نتیجه‌گیری
پیشنهاد می‌شود که با توجه به این مهم که پلی‌مورفیسم‌ها و واریانت‌ها می‌توانند در قومیت‌های مختلف پراکندگی متفاوتی داشته باشند و با توجه به چند قومیتی بودن کشورمان در نواحی و اقوام مختلف مطالعات مشابه به منظور شناخت بهتر این بیماری صورت بگیرد.
سپاس‌گزاری
مطالعه حاضر حاصل پایان‌نامه دانشجویی بوده که با کد 6725 در دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی- درمانی شهید صدوقی یزد مصوب گردیده است. از تمامی عزیزانی که ما را در انجام این پژوهش یاری کردند سپاسگزاریم.
حامی مالی: دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی- درمانی شهید صدوقی یزد
تعارض در منافع: وجود ندارد.
 
 

References:
 
1-    Kidd PM. Multiple Sclerosis, An Autoimmune Inflammatory Disease: Prospects for its Integrative Management. Altern Med Rev 2001; 6(6): 540-66.
2-    Goldenberg MM. Multiple Sclerosis Review. Pharmacy and Therapeutics 2013; 37(3): 175-84.
3-    Etemadifar M, Sajjadi S, Nasr Z, Firoozeei TS, Abtahi S-H, Akbari M, et al. Epidemiology of Multiple Sclerosis in Iran: A Systematic Review. Eur Neurol 2013; 70(5-6): 356-63.
4-    Rog DJ, Mottershead JP. The Role of Interferon Beta in Multiple Sclerosis Management. Future Prescriber 2006; 7(3): 15-9.
5-    Pereira VCSR, Malfetano FR, Meira IDA, Souza LFd, Liem AM, Maiolino A, et al. Clinical Response to Interferon Beta and Glatiramer Acetate in Multiple Sclerosis Patients: A Brazilian Cohort. Arq Neuropsiquiatria 2012; 70(10): 774-9.
6-    Canto E, Oksenberg JR. Multiple Sclerosis Genetics. MSJ 2018; 24(1): 75-9.
7-    Arai H, Miyamoto KI, Taketani Y, Yamamoto H, Iemori Y, Morita K, et al. A Vitamin D Receptor Gene Polymorphism in the Translation Initiation Codon: Effect on Protein Activity and Relation to Bone Mineral Density in Japanese Women. J Bone Miner Res 1997; 12(6): 915-21.
8-    Yucel FE, Kamıslı O, Acar C, Sozen M, Tecellioğlu M, Ozcan C. Analysis of Vitamin D Receptor Polymorphisms in Patients with Familial Multiple Sclerosis. Med Arch 2018;72(1): 58.
9-    Cakina S, Ocak O, Ozkan A, Yucel S, Karaman HIO. Vitamin D Receptor Gene Polymorphisms in Multiple Sclerosis Disease: A Case-Control Study. Revista Romana de Medicina de Laborator 2018; 26(4): 489-95.
10-    Jedrzejuk D, Łaczmański Ł, Milewicz A, Kuliczkowska-Płaksej J, Lenarcik-Kabza A, Hirnle L, et al. Classic PCOS Phenotype is Not Associated with Deficiency of Endogenous Vitamin D and VDR Gene Polymorphisms Rs731236 (Taqi), Rs7975232 (Apai), Rs1544410 (Bsmi), Rs10735810 (Foki): a Case–Control Study of Lower Silesian Women. Gynecol Endocrinol 2015; 31(12): 976-9.
11-    Fukazawa T, Yabe I, Kikuchi S, Sasaki H, Hamada T, Miyasaka K, et al. Association of Vitamin D Receptor Gene Polymorphism with Multiple Sclerosis in Japanese. J Neurol Sci 1999; 166(1): 47-52.
12-    Tajouri L, Ovcaric M, Curtain R, Johnson MP, Griffiths LR, Csurhes P, et al. Variation in the Vitamin D Receptor Gene is Associated with Multiple Sclerosis in an Australian Population. J Neurogenet 2005; 19(1): 25-38.
13-    Čierny D, Michalik J, Škereňová M, Kantorová E, Sivák Š, Javor J, et al. Apai, Bsmi and Taqi VDR Gene Polymorphisms in Association with Multiple Sclerosis in Slovaks. Neurol Res 2016; 38(8): 678-84.
14-    Al-Temaimi RA, Al-Enezi A, Al-Serri A, Al-Roughani R, Al-Mulla F. The Association of Vitamin D Receptor Polymorphisms with Multiple Sclerosis in a Case-Control Study from Kuwait. PloS One 2015; 10(12): e0142265.
15-    Ben‐Selma W, Ben‐Fredj N, Chebel S, Frih‐Ayed M, Aouni M, Boukadida J. Age‐And Gender‐Specific Effects on VDR Gene Polymorphisms and Risk of the Development of Multiple Sclerosis in Tunisians: A Preliminary Study. Int J Immunogenet 2015; 42(3): 174-81.
16-    Kamisli O, Acar C, Sozen M, Tecellioglu M, Yücel FE, Vaizoglu D, et al. The Association between Vitamin D Receptor Polymorphisms and Multiple Sclerosis in a Turkish Population. Mult Scler Relat Disord 2018; 20: 78-81.
17-    Narooie-Nejad M, Moossavi M, Torkamanzehi A, Moghtaderi A, Salimi S. Vitamin D Receptor Gene Polymorphism and the Risk of Multiple Sclerosis in South Eastern of Iran. J Mol Neurosci 2015; 56(3): 572-6.
18-    Abdollahzadeh R, Fard MS, Rahmani F, Moloudi K, Azarnezhad A. Predisposing Role of Vitamin D Receptor (VDR) Polymorphisms in the Development of Multiple Sclerosis: A Case-Control Study. J Neurol Sci 2016; 367: 148-51.
19-    Agnello L, Scazzone C, Sasso BL, Bellia C, Bivona G, Realmuto S, et al. VDBP, CYP27B1, and 25-Hydroxyvitamin D Gene Polymorphism Analyses in a Group of Sicilian Multiple Sclerosis Patients. Biochem Genet 2017; 55(2): 183-92.
20-    Tizaoui K, Kaabachi W, Hamzaoui A, Hamzaoui K. Association between Vitamin D Receptor Polymorphisms and Multiple Sclerosis: Systematic Review and Meta-Analysis of Case–Control Studies. Cell mol immunol 2015; 12(2): 243-52.