ماهنامه علمی پ‍ژوهشی

مقدمه
سرطان بیماری است که در اثر تغییرات ژنتیکی غیر معمول به‌ واسطه جهش در ژن‌های مهار کننده تومور و انکوژن‌ها و اختلالات کروموزومی ایجاد می‌شود. اما اخیرا مشخص شده است که سرطان می‌تواند در اثر تغییرات اپی‌ژنتیکی نیز ایجاد می‌شود (1). سرطان پستان یکی از رایج‌ترین انواع سرطان و دومین عامل مرگ و میر ناشی از سرطان در میان زنان می‌باشد (2). سرطان پستان یک بیماری هتروژن بوده که به علت تغییرات ژنتیکی مانند از دست دادن یا به‌دست آوردن کروموزوم‌ها، موتاسیون‌ها و بازآرایی ژنومی رخ می‌دهد (3). در سال بیش از یک میلیون سرطان پستان تشخیص داده می‌شود که بیش از 500 هزار نفر در اثر این بیماری فوت می‌شوند (4). این سلول‌ها دارای رشد غیرطبیعی و نقص در فرآیند آپوپتوز می‌باشند. نقص در آپوپتوز نقش مهمی در رشد سلول‌های سرطانی دارد. داده‌های اخیر نشان داده است که BIM یک عضو پروتئین آپوپتوزی از خانواده Bcl-2 به عنوان یک واسطه مهم برای القای آپوپتوز و درمان در سرطان‌های مختلف از جمله سرطان خون است (5). ژن BIM یکی از مهم‌ترین ژن‌های مسیر داخلی (میتوکندریایی) آپوپتوز است (6). روش‌های درمان سرطان شامل درمان موضعی و سیستمیک است که درمان موضعی شامل موارد جراحی و رادیوتراپی، پیوند مغز استخوان، درمان ایمونوتراپی و هایپرتومی می¬باشد. درمان‌های سیستمیک شامل شیمی‌ درمانی و هورمون درمانی است. از میان روش‌های درمانی شیمی درمانی بیشترین کاربرد را دارد ولی دارای عوارض فراوانی است. از عوارض این روش می‌توان به ریزش مو، اختلالات خواب، مشکلات حافظه و تمرکز اشاره نمود (7). با توجه به عوارض ناخوشایند روش‌های درمانی سرطان، همواره تلاش بر یافتن روش‌ها و ترکیبات با حداقل آسیب برای این گروه از بیمارن مورد توجه و جستجو بوده است. در این راستا، استفاده از گیاهان دارویی از زمان‌های بسیار قدیم مطرح بوده است و در دهه‌های اخیر استفاده از این گیاهان به صورت فراورده های دارویی استفاده می‌شود (8). مواد موثر موجود در گیاهان دارویی به دلیل همراه بودن با مواد دیگر پیوسته از یک حالت تعادل بیولوژیک برخوردار هستند و در نتیجه در بدن انباشته نمی شوند و اثرات جانبی به بار نمی‌آورند (9). گیاه رزماری (Salvia rosmarinus) متعلق به خانواده Labiabida است. اجزاء فعال از این خانواده از گیاهان عبارتند از دی ترپن ها و تری ترپن ها. این ترکیبات اثرات آنتی‌اکسیدانی بالایی دارند. هم‌چنین اسید اورسولیک دارای خواص ضد سرطانی و ضد التهابی است (12-10). با توجه به عوارض استفاده از داروهای شیمیایی و به منظور کاهش این عوارض و هم‌چنین جهت بررسی اثربخشی ترکیبات گیاهی در بهبود سرطان، این پژوهش انجام شد. با توجه به خواص ضد سرطانی و آنتی‌اکسیدانی ترکیبات رزماری، هدف از انجام این مطالعه بررسی اثر اسانس رزماری بر بیان ژن BIM در رده سلولی MCF-7  سرطان پستان می باشد.
روش‌بررسی
گیاه رزماری
گیاه رزماری از مرکز رشد واحد های فناور گیاهان دارویی جهاد دانشگاهی یزد تهیه و تا زمان استفاده به صورت خشک شده نگهداری شد.
استخراج اسانس
جهت تهیه اسانس رزماری از دستگاه کلونجر استفاده شد. در ابتدا گیاه رزماری به صورت پودر درآمد. به منظور تهیه اسانس، پودر گیاه در بالن دستگاه ریخته شده و 2/3 بالن از آب مقطر پر شد. اسانس حاصل پس از 6 ساعت اسانس گیری جمع‌آوری گردید. اسانس به‌دست آمده در یخچال و دور از نور تا زمان استفاده نگهداری شد.
کشت سلول
رده سلولی سرطان پستان (MCF-7) از بانک سلولی انستیتو پاستور (تهران، ایران) تهیه شد. برای کشت سلول از محیط کشت DMEM حاوی 10% سرم (FBS) استفاده شده و سلول‌ها در انکوباتور با دمای C °37 و در شرایط دارای 5% CO2 و رطوبت 95% نگهداری شدند.

بررسی اثر سمیت سلولی اسانس رزماری (تست MTT)
در این مرحله تعداد 10 هزار سلول MCF-7 در هر چاهک از پلیت 96 خانه کشت داده شده و پس از 24 ساعت و چسبیدن سلولها به کف چاهک‌ها، در معرض غلظت های مختلفی از اسانس رزماری شامل 500، 250، 125، 100، 50، 25 و 10 میکروگرم بر میلی لیتر قرار داده شد. پس از گذشت زمانهای 24، 48 و 72 ساعت، پلیتها در معرض MTT و سپس DMSO (Dimethyl sulfoxide) قرار داده شدند. در نهایت، نتایج توسط میکروپلیت ریدر در طول موج 570 نانومتر قرائت گردید.
محاسبه IC50
در هر یک از زمان های 24، 48 و 72 ساعت، محاسبه IC50 جهت به دست آوردن درصد توان حیاتی سلولهای MCF-7 در مقابل دوزهای مشخصی از اسانس گیاه رزماری انجام شد. بررسی بیان ژن BIM
استخراج RNA
کیت استخراج RNA از شرکت دنا زیست (مشهد، ایران) تهیه شد. در این مرحله 500 هزار سلول درون هر چاهک از پلیت 6 خانه کشت داده شد. پس از 24 ساعت، اسانس رزماری با غلظت‌های 125، 100 و 50 میکروگرم بر میلی‌لیتر به چاهک‌ها اضافه شد. بعد از گذشت 24 ساعت استخراج RNA مطابق دستورالعمل کیت خریداری شده (شرکت دنا زیست، مشهد،) انجام شد (شکل1).
 

شکل 1: مراحل استخراج RNA
 
بررسی کیفیت RNA
جهت اطمینان از کیفیت RNA استخراج شده، نمونه‌ها روی ژل آگارز 2 درصد مشاهده شدند.
بررسی کمیت RNA
بررسی کمی RNA استخراج شده شامل غلظت و خلوص آن با استفاده از دستگاه نانودراپ ارزیابی شد.
سنتز cDNA
ساخت cDNA از RNA های استخراج شده توسط کیت RT–PCR kit ساخت شرکت پارس توس (مشهد، ایران) انجام شد. سپس، با استفاده از دستگاه PCR و بر اساس برنامه دمایی و زمانی اشاره شده در جدول 1، cDNA سنتز شد.
طراحی پرایمر‌ها
طراحی پرایمر برای ژن‌های BIM و GAPDH با استفاده از نرم‌افزار Primer 3 مطابق جدول 2 صورت گرفت. ژن GAPDH به عنوان کنترل داخلی منظور گردید.
Real Time PCR
هدف از انجام واکنش Real Time PCR سنجش میزان بیان ژنBIM  تحت تاثیر اسانس رزماری می باشد. جهت انجامReal Time PCR ، ابتدا مخلوط واکنش برای هر نمونه شامل پرایمرهای پیشرو (F) و پسرو (R) اختصاصی، cDNA، رنگ سایبر گرین (Takara, Japan) و آب بدون نوکلئاز تهیه شد. سپس مخلوط واکنش آماده شده بر روی یخ با حجم نهایی 20 میکرولیتر طی مراحل مختلف واکنش تحت تأثیر برنامه دمایی زمانی به شرح جدول 3 قرار گرفتند. پس از پایان واکنش به منظور تأیید اختصاصی بودن محصول و عدم حضور محصولات غیراختصاصی، آنالیز منحنی ذوب صورت گرفت. جهت ارزیابی تغییرات بیان ژن مورد نظر از روش –ΔΔCt2 استفاده شد.
تجزیه و تحلیل آماری
داده‌ها به صورت Mean ± SD گزارش شدند. آنالیز آماری داده‌های حاصل از این مطالعه با استفاده از نرم‌افزار VERSION 16 SPSS صورت گرفت. جهت بررسی تفاوت‌های ایجاد شده ناشی از تاثیر اسانس بر میزان بقای سلولی و بیان ژن BIM در سلول‌های تیمار شده با اسانس رزماری از آزمون تحلیل واریانس (ANOVA) و Student's T-test در سطح معنی‌داری 0/05 استفاده گردید.
ملاحظات اخلاقی
پروپوزال این پژوهش توسط مرکز تحقیقات ناباروری دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد با کد اخلاق IR.SSU.RSI.REC.1398.039 مورد تأیید قرار گرفته است.

جدول 1: سیکل های سنتز cDNA



جدول 2: مشخصات آغازگرها


جدول 3: برنامه زمانی دمایی واکنش Real Time PCR


نتایج
بررسی اثر سمیت سلولی بر سلول های MCF-7
میزان سایتوتوکسیسیتی اسانس رزماری با استفاده از تست MTT بررسی شد. نتایج نشان داد که میزان سایتوتوکسیسیتی اسانس رزماری وابسته به دوز و زمان می‌باشد. در شکل 2، تاثیر اسانس رزماری در زمان‌های 24، 48 و 72 ساعت بر میزان بقای سلولی نشان داده شده است. پس از گذشت 24، 48 و 72 ساعت (در هر سه زمان) میزان بقای سلولی (viability) به طور معنی‌داری با افزایش غلظت اسانس کاهش یافته که این کاهش با افزایش غلظت اسانس متناسب بوده است (P=0/023). نتایج نشان می‌دهد که میزان بروز سمیت سلولی و تغییرات حاصل در درصد بقای سلول‌های سرطان پستان در تمام غلظت ها تفاوت معنی‌داری را از خود نشان می‌دهد (شکل 2). جدول 4 میزان IC50 اسانس رزماری پس از اثرگذاری بر سلول‌های سرطان پستان، رده سلولی MCF-7 در زمان های 24، 48 و 72 ساعت را نشان می‌دهد.
تست تایید پرایمر
در این تست بهینه دمای اتصال پرایمر به توالی مورد نظر برای انجام PCR با ژل (1 درصد) الکتروفورز به‌دست آمد. به این صورت که دما 60 درجه سانتیگراد برای پرایمر در نظر گرفته شد و با تنظیم دستگاه PCR روی این دماها برای 2 نمونه، محصولات PCR روی ژل برده شد.
بررسی بیان ژن BIM  تحت تاثیر اسانس رزماری
آنالیزمنحنی ذوب مربوط به ژن های BIM و GAPDH
یکی دیگر از ویژگی‌های دستگاه Real Time PCR رسم منحنی ذوب می باشد. دمای ذوب به طول و تعداد نوکلئوتید ساختمان DNA و درصد GC بستگی دارد (شکل 3).
نتایج آزمون Real Time PCR
تغییرات میزان بیان ژن BIM در (شکل 4) نشان داده شده است. همان طور که مشاهده می‌گردد بیان ژن BIM به عنوان یک ژن پیش برنده آپوپتوز با افزایش غلظت اسانس نسبت به گروه کنترل به طور معنی‌داری افزایش یافته است (P=0/018)
 

    

شکل 2: تاثیر اسانس رزماری بر درصد بقای سلولی در زمان‌های 24، 48 و 72 ساعت

جدول 4: IC50 ناشی از اثرگذاری اسانس رزماری بر سلول‌های سرطان پستان





شکل 3: منحنی ذوب ژن های BIM  و GAPDH در سلول‌های تیمار شده با اسانس رزماری که نمایانگر اختصاصی بودن محصول واکنش است.
هر پیک نمایانگر یک محصول PCR است.


شکل 4: مقایسه میزان بیان ژن BIM در سلول‌های تیمار شده با اسانس رزماری در مقایسه با گروه کنترل.
* P˂0.05 اختلاف معنادار با گروه کنترل را نشان می‌دهد.

 بحث
آپوپتوز یک فرایند سلولی منظم و مرتب است که در شرایط فیزیولوژیک و پاتولوژیک اتفاق می افتد. شناخت مکانیزم پایه آپوپتوز مهم است زیرا نقش مهمی در پاتوژنز بسیاری از بیماری‌ها دارد. سرطان یکی از سناریوهایی است که آپوپتوز بسیار کمی در آن رخ می‌دهد و موجب سلول‌های بدخیمی می‌شود که نمی‌میرند. سرطان پستان شایع‌ترین سرطان در میان زنان ایرانی است. طبق آمار جدید در ایران، سالانه 6160 سرطان پستان تشخیص داده می‌شود و 1063 مورد مرگ و میر ناشی از آن است (14،13). اسانس رزماری خواص آنتی‌اکسیدانی دارد که این خاصیت به علت وجود ترکیباتی همچون ترکیبات فنولی، رزمارینیک اسید، کافئیک اسید، کارنوسول و فلاوونوئید‌ها است که در درمان سرطان مورد استفاده قرار می‌گیرند (9). در مطالعه حاضر، جهت ارزیابی سمیت اسانس رزماری از آزمون MTT که یک آزمون استاندارد برای ارزیابی میزان بقاء سلول می‌باشد استفاده شد. نتایج حاصل از این پژوهش به طور‌کلی، اثرات مهاری اسانس رزماری را بر رده سلولی سرطان پستان نشان داد. یافته‌های تحقیقاتی گذشته حاکی از این است که اسانس رزماری گسترش برخی از سلول های توموری را مهار می‌کند در سال 2011،SUONG N. T. NGO و همکارانش اثر رزماری را بر روی سرطان کولورکتال بررسی کردند. آن‌ها در تحقیقاتشان به شواهد علمی از تمام مطالعات منتشر شده از سال 1996 تا مارس 2010 در خصوص اثرات محافظتی رزماری بر روی سرطان کولورکتال و سایر انواع سرطان اشاره کرده¬اند. علاوه بر این، خواص ضد سرطانی رزماری از طریق تغییرات مولکولی در فرآیند چند مرحله ای توسعه سرطان که وابسته به دوز است نه بافت یا گونه خاص، کشف شده است. نشان داده شده است که رزماری قادر به سرکوب کردن تومور در چندین اندام از جمله کولون، پستان، کبد، معده و هم‌چنین ملانوم و سلول‌های لوسمی را دارد. نتایج این مطالعات نشان داده است که ترکیبات گیاه رزماری اهداف مختلف مولکولی را تحت تأثیر قرار داده و اجزای فعال آن شاخص‌های مفید موفقیت در آزمایشات پیشگیری شیمیایی سرطان می‌‌باشند (10). در سال 2015، Margarita Gonzalez-Vallinas و همکارانش اثر عصاره رزماری به عنوان یک عامل بالقوه در درمان سرطان را برسی کردند. در گزارشات آن ها آمده است که رزماری دارای فعالیت ضد سرطان در مطالعات in vitro و حیوانی است. خاصیت ضد توموری رزماری به دلیل فعالیت آنتی‌اکسیدانی آن است. نتایج حاصل از تحقیقات آن‌ها نشان می‌دهد که عصاره رزماری خاصیت ضد توموری مختلف در طیف گسترده‌ای از انواع سرطان را دارد. مفید بودن این عصاره به عنوان عامل مکمل برای بیماران خاص سرطانی است (15). در سال 2013، Sakina M. Petiwala و همکارانش تاثیر پلی‌فنل گیاه رزماری بر روی سرطان پروستات را مورد بررسی قرار دادند. مطالعات اپیدمیولوژیک نشان می‌دهد خطر ابتلا به سرطان در بیمارانی که رزماری مصرف می‌کنند کاهش می‌یابد. در واقع کارنوزیک اسید و کارنوسول موجود در رزماری سرطان پروستات را مهار می‌کند. در واقع کارنوزیک اسید و کارنوسول از طریق ترویج آپوپتوز و مهار مسیر سیگنالینگ PI3K/Akt که یک تنظیم کننده مهم در بقای سلول‌های توموری است را مهار می‌کند (16). در این مطالعه هم‌چنین تأثیر اسانس رزماری بر بیان ژن پروآپوپتوتیک BIM بر روی سلول‌های سرطان پستان (رده سلولی MCF-7) توسط تکنیکReal Time PCR مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان میدهد اسانس رزماری باعث افزایش بیان ژن BIM گردیده است. نتایج تحقیقات صورت گرفته بر تأثیر اسانس گیاهان مختلف بر بیان ژن های آپوپتوتیک در انواع سرطانها نشان می‌‌دهد که ترکیبات گیاهی قادر به القای تغییر در میزان بیان این ژنها میباشند. در سال 2017، احمدی و همکاران و در سال 2018، پیروزمند و همکاران تاثیر عصاره و اسانس‌های گیاهی (برگ سدر و گیاه هلی‌کریزوم) را بر بیان ژن‌های آپوپتوتیک در سرطان‌های پستان و کولون مورد ارزیابی قرار دادند. نتایج حاکی از آن بود که عصاره‌‌های مذکور باعث افزایش معنی داری در بیان ژن پروآپوپتوتیک BAX و افزایش مرگ سلول‌های سرطانی در هر دو سرطان پستان و کولون شده است (18،17). نتایج این مطالعات با یافته‌‌های حاصل از این پژوهش که نشان دهنده توان ترکیبات گیاه رزماری در تغییر میزان بیان ژن پروآپوپتوتیک و افزایش مرگ سلولهای سرطان پستان می‌باشد، مطابقت دارد. Park و همکارانش طی مطالعه‌ای در سال 2016 نشان دادند که کارنوزیک اسید که مهم‌ترین جزء از ترکیبات گیاه رزماری است می‌تواند با افزایش بیان ژن‌های پروآپوپتوتیک سبب القای آپوپتوز در کارسینومای کلیه شود (19). یافته‌های مطالعه Moore و همکاران در سال 2016 نشان داد که اسید کارنوزیک رزماری در رده سلولی MDA-MB-361 از سرطان پستان، با کاهش بیان ژن آنتی‌آپوپتوتیک Bcl-2 و افزایش بیان ژن پروآپوپتوتیک BIM می‌تواند بقای سلول‌های سرطانی را مهار کند (20). یافته‌های هر دو مطالعه با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد. البته شایان ذکر است محدودیت مطالعه حاضر، عدم بررسی اثربخشی ترکیب مورد استفاده در شرایط in vivo می‌باشد.
نتیجه‌گیری
با استناد به یافته‌های این پژوهش و با توجه به مطالعات سایر پژوهش‌گران، می توان نتیجه گرفت که احتمالاً گیاه رزماری به دلیل وجود ترکیباتی همچون اسید کارنوزیک قادر به القاء تغییراتی در بیان ژن‌های آپوپتوتیک و در نتیجه مهار سلول‌های سرطانی است. در این مطالعه، با توجه به تایید خاصیت آنتی اکسیدانی اسانس رزماری و نتایج حاصل از بررسی بقای سلول‌ها در اثر تیمار با اسانس رزماری و تایید خاصیت کشندگی این اسانس بر روی سلول‌های رده MCF-7 و کاهش بقای این سلول‌ها، از اسانس رزماری می‌توان به عنوان ترکیبات آنتی اکسیدان و سایتوتوکسیک علیه سلول‌های سرطانی رده MCF-7 مورد استفاده قرار گیرد. هم‌چنین در مطالعات بعدی می‌توان اثربخشی اسانس رزماری را بر سایر ژن‌های آپوپتوزی و مسیرهای سیگنالینگ دیگری در هر دو شرایط in vitro و in vivo مورد بررسی قرار داد.
سپاس‌گزاری
این مطالعه حاصل پایان‌نامه دانشجویی است. بدین‌وسیله نویسندگان مراتب تشکر و قدر‌دانی خود را از حمایت‌های دانشگاه علم و هنر و شرکت دانش بنیان ریز زیست فناوران فردا نگر در در راستای انجام این مطالعه ابراز می‌دارند.
حامی مالی: ندارد.
تعارض در منافع: وجود ندارد.
 

References:
 
1-    Reya T, Morrison SJ, Clarke MF, Weissman IL. Stem Cells, Cancer, and Cancer Stem Cells. Nature 2001; 414(6859): 105-11.
2-    Wu Q, Wang C, Lu Z, Guo L, Ge Q. Analysis of Serum Genome-Wide Micrornas for Breast Cancer Detection. Clinica Chimica Acta 2012; 413(13-14): 1058-65.
3-    Thakur A, Xu H, Wang Y, Bollig A, Biliran H, Liao JD . The Role of X-Linked Genes in Breast Cancer. Breast Cancer Research and Treatment 2005; 93(2): 135-43.
4-    Anderson WF, Chu KC, Chatterjee N, Brawley O, Brinton LA. Tumor Variants by Hormone Receptor Expression in White Patients With Node-Negative Breast Cancer from the Surveillance, Epidemiology, and End Results Database. J Clinical Oncology 2001; 19(1): 18-27.
5-    Faber AC, Corcoran RB, Ebi H, Sequist LV, Waltman BA, Chung E, et al. BIM Expression in Treatment Naive Cancers Predicts Responsiveness to Kinase Inhibitors. Cancer Discov 2011; 1(4): 352-65.
6-    Shuang T, Shi C, Chang S, Wang M, Bai CH. Downregulation of miR-17~ 92 Expression Increase Paclitaxel Sensitivity in Human Ovarian Carcinoma SKOV3-TR30 Cells via BIM Instead of PTEN. Int J Mol Sci 2013; 14(2): 3802-16.
7-    Nooshinfar E, Bashash D, Mohamadi G, Taghavi A, Shahani M, Hoseini L, Akbari ME. Melatonin and Its Importance in Breast Cancer Prevention and Treatment (A Purposed Review Article). The Iranian Journal of Obstetrics, Gynecology and Infertility 2014; 17(118): 10-21.
8-    Ernst E. Heavy Metals in Traditional Indian Remedies. Eur J Clin Pharmacol 2002; 57(12): 891-6.
9-    Hao D, Xiao Jie G, Pei Gen X. Medicinal Plants, Chemistry, Biology and Omics. 1th Ed. London; Woodhead Publishing-Elsevier; 2015.
10-    Ngo SN, Williams DB, Head RJ. Rosemary and Cancer Prevention: Preclinical Perspectives. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 2011; 51(10): 946-54.
11-    Al-otaibi,Waad.Rosemary Oil Nano-Emulsion Potentiates the Apoptotic Effect of Mitomycin C on Cancer Cells in Vitro. Pharmacia 2021; 68: 201-9.
12-    ‏ Moller AC, Parra C, Said B, Werner E, Flores S, Villena J, et al. Antioxidant and Anti-Proliferative Activity of Essential Oil and Main Components from Leaves of Aloysia polystachya Harvested in Central Chile. Molecules 2021; 26(1): 131.‏
13-    Otaghvar HA, Hosseini M, Tizmaghz A, Shabestanipour G, Noori H. A Review on Metastatic Breast Cancer in Iran. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 2015; 5(6): 429-33.
14-    Alizadeh Otaghvar H, Hosseini M, Tizmaghz A, Shabestanipour G, Noori H. A Review on Metastatic Breast Cancer in Iran. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 2015; 5(6): 429-33.
15-    González-Vallinas M, Reglero G, Ramírez de Molina A. Rosemary (Rosmarinus Officinalis L.) Extract as a Potential Complementary Agent in Anticancer Therapy. Nutrition and cancer 2015; 67(8): 1223-31.
16-    Petiwala SM, Puthenveetil AG, Johnson J. Polyphenols from the Mediterranean Herb Rosemary (Rosmarinus Officinalis) for Prostate Cancer. Front pharmacol 2013; 4: 29.
17-    Ahmadi R, Rahimi S, Ehteshamzad N. The Effect of Hydroalcoholic Ziziphus Spina-Christi Leaf Extract on Viability of Breast Cancer Cell Line (MCF7) and Evaluation of Bax and Bcl2 Genes Expression Level. Feyz 2017; 21(5): 407-13.
18-    Mirzaie A, Piroozmand S, Mousavi Z, RustaiyanA. Investigation of Chemical Composition of Helichrysum artemisioides Essential Oil, and its Antibacterial and Cytotoxic Effects on Colon Cancer Cell Line and Analysis of Apoptotic Gene Expression Using PCR Method. Qom Uni  Med Sci J 2018; 12(3): 9-18.
19-    Park EJ, Park B, Chae IG, Kim D, Kundu J, Kundu JK, Chun K. Carnosic Acid Induces Apoptosis Through Inactivation of Src/STAT3 Signaling Pathway in Human Renal Carcinoma Caki Cells. Onchology Reports 2016; 35(5): 2723-32.
20-    Moore J, Yousef M, Tsiani E. Anticancer Effects of Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) Extract and Rosemary Extract Polyphenols‏. Nutrients 2016; 8: 731-63.