ماهنامه علمی پ‍ژوهشی

مقدمه
بیماری داسی‌شدن (SCD) یک هموگلوبینوپاتی تاشی از هموگلوبین غیرطبیعی داسی (HbS) است و داکسیژنه شدن HbS منجر به پلیمریزه شدن آن و تغییرات ساختاری اریتروسیت‌ها به‌صورت داسی می‌شود (1). SCD با داسی‌شدن سلول‌های قرمز خون (RBC)، آنمی همولیتیک مزمن، انسداد وازو اپیزودیک همراه با درد و التهاب شدید، آسیب حاد و تجمعی اندام که به صورت سکته، سندرم حاد قفسه سینه، بیماری ریه داسی، فشار خون ریوی، بیماری کلیوی و سایر بیماری‌های مزمن ظاهر می‌شود (2). با توجه به پیچیدگی پاتوفیزیولوژی SCD، تا کنون چندین استراتژی درمانی بررسی شده است. یکی از استراتژی‌ها عوامل ضد‌داسی شدن است. عواملی که منحنی تفکیک اکسیژن را تغییر می¬دهند یا ساختار HbS را به حالت اکسیژنه درآورند، باعث کاهش پلیمریزاسیون Hb و در نتیجه کاهش داسی شدن سلول‌ها، کاهش همولیز و بهبود آنمی می‌گردد (2). طبق مطالعات انجام شده، میوه گیاه فلوس حاوی مواد مختلفی از جمله فلاوونوئیدها (3)، آنتراکوئینون‌ها (4) و فورفورال (5) هست که جز ترکیبات ضد داسی شدن طبقه‌بندی می¬شوند (2). داروهای گیاهی نقش مهمی در درمان بیماری‌های مختلف دارند و در مقایسه با سایر سیستم‌های پزشکی کم‌هزینه هستند. بر اساس گزارش‌های سازمان بهداشت جهانی، 80% مردم در کشورهای در حال توسعه هنوز برای تأمین نیازهای بهداشتی اولیه خود از داروهای گیاهی استفاده می‌کنند (6,7). گیــاه فلــوس بــا نــام علمــی Cassia Fistula در طب سنتی استفاده می‌شود (8،9) و تمام قسمت‌های گیاه مصارف درمـانی زیادی از جمله تسکین درد (10)، ضد تب و درمان عفونت‌ها داشته و به عنوان آنتی‌اکسیدان نیز عمل می کند (11). ولی مهم‌ترین و شناخته شده‌ترین قسمت گیـاه میـوه آن اسـت (12). طبق مطالعه‌ای که اثرات درمانی این گیاه را بر روی موش بررسی‌کردند، هیچ نشانه‌ای از سمیت تا دوزmg/po (per os) 2000 مشاهده نشده  است (7). با توجه به وجود ترکیبات ضد‌ داسی‌شدن در میوه گیاه فلوس و کاربردهای زیادی که این گیاه در طب سنتی داشته است، و هم‌چنین با توجه به اینکه این میوه توسط درمانگران سنتی برای بیماران مبتلا به SCD تجویز می‌شود، از این‌رو این مطالعه به منظور تعیین اثر عصاره متانولی میـوه گیـاه فلوس بر داسی شدن سلول های داسی شکل، در شرایط آزمایشگاهی انجام گردید.
روش بررسی
نمونه‌های خون: در این مطالعه تجربی (آزمایشگاهی)، نمونه‌های خون کامل 25 فرد مبتلا به SCT مراجعه‌کننده به درمانگاه بیمارستان شفا اهواز، جمع‌آوری شد. این افراد در وضعیت پایدار بیماری بوده و هیچ داروی گیاهی مصرف نکرده‌ بودند. پنج فرد سالم نیز به عنوان کنترل در نظر گرفته  شد. نمونه به میزان 2 سی‌سی در لوله‌های پلاستیکی با 0/2 گرم اتیلن‌دی‌آمین‌تترااستیک اسید (EDTA) جمع‌آوری شده  بود. در این نمونه‌ها، مورفولوژی خون محیطی طبیعی و آزمایش داسی‌شدن مثبت بود (شکل a.1 و b.1).
تهیه عصاره: گیاه فلوس توسط جناب آقای دکتر محمد‌طه جلالی جهت انجام این پروژه معرفی شد. میوه از گیاهان فلوس موجود در استان خوزستان تهیه شد. عصاره متانولی میوه گیاه فلوس به شکل ماسیراسیون با استفاده از روش تقطیر در خلاء (روتاری اواپراتور) به‌دست آمد. ابتدا میوه گیاه فلوس پودر شد و سپس اتانول 70% (Merck، ساخت آلمان) اضافه شد تا غلظت mg / ml 0/07 (پودر به الکل 70%) حاصل شود. سپس به مدت 72 ساعت در دمای اتاق نگهداری  شده و پس از فیلتراسیون توسط یک کندانسور متراکم شد. سپس مواد تغلیظ‌ شده در دمای 40 درجه سانتی‌گراد خشک شدند. به منظور تهیه رقت‌های مختلف عصاره، ابتدا 0/48 گرم (با ترازو Kern، ساخت انگلیس) از عصاره به 5 میلی لیتر سرم فیزیولوژی 0/9‌% (Merck، ساخت آلمان) اضافه شد. سپس 7 رقت 1: 2، 1 : 4، 1: 8، 1: 16، 1: 50، 1: 100 و 1: 200 تهیه شد.
فعالیت ضد داسی شدن: گلبول های قرمز مربوط به نمونه‌های بیماران و افراد کنترل سه بار با سرم فیزیولوژی 0/9‌% شسته‌شده، با رقت‌های مختلف عصاره متانولی فلوس در لوله‌های شیشه‌‌ای مخلوط شده و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد در انکوباتور (BINDER، ساخت آلمان) انکوبه شدند. سپس آزمایش داسی‌شدن برای هر لوله انجام شد. برای این آزمایش، مقدار 50 میکرولیتر از نمونه موجود در هر لوله در مجاورت 100 میکرولیتر از محلول سدیم متا بی‌سولفیت 0/2 گرم در لیتر (Merck، ساخت آلمان) قرار داده شد. بعد از 15 دقیقه، درصد سلول‌های داسی شکل با استفاده از میکروسکوپ المپیوس (قدرت = 40*) برآورد شد. برای کسب اطمینان بیشتر، این آزمون در زمان‌های 30، 60 و 120 دقیقه نیز انجام شد. در صورتی‌که آزمایش منفی رخ دهد، نشان می‌دهد که روند داسی‌شکل کاهش یافته و مجاورت با عصاره فلوس کارآمد است.
تجزیه و تحلیل آماری
داده‌ها با نرم‌افزارversion 16  SPSS آنالیز شدند. برای مقایسه میانگین درصد سلول‌های داسی شکل قبل و بعد از درمان با عصاره فلوس از آزمون ویلکاکسون استفاده شد. حدود اطمینان 95% و سطح معنی‌داری 0/05در نظر گرفته شد.

ملاحظات اخلاقی
پروپوزال این تحقیق توسط دانشگاه علوم پزشکی جندی‌شاپور اهواز تایید شده است (شماره پروژه: 90S3).
نتایج
افراد مبتلا به خصیصه داسی‌شکل شرکت‌کننده در این مطالعه، 16 (64%) مرد و 9 (36%) زن بودند. میانگین سنی افراد 17 سال (‌حداقل 3 سال و حداکثر 27 سال) بود. آزمایش داسی‌شدن گروه نرمال و گروه خصیصه داسی‌شکل به ترتیب منفی و مثبت بود (شکل a.1 و b.1). بعد از مجاورت سلول‌های خصیصه داسی‌شکل با رقت های 1: 2، 1: 4، 1: 8 و 1: 16 عصاره متانولی گیاه فلوس، آزمایش داسی‌شدن منفی بود و هیچ سلول داسی‌شکلی مشاهده نشد. میزان داسی‌شدن در رقت‌های 1:50، 1: 100 و 1: 200، به‌ترتیب 24% ، 37/8% و 46/1‌% بود (شکل a.2 و b.2 و c.2). براساس آزمون ویلکاکسون میزان داسی‌شدن در رقت‌های 1: 2، 1 : 4، 1: 8، 1: 16، 1: 50 و 1: 100 به‌طور معنی‌داری کاهش داشته است (P <0/05).
 


شکل 1:a. اسلاید مستقیم در یک فرد مبتلا به خصیصه داسی‌شکل قبل از تداخل



شکل 1:b . آزمایش داسی‌شدن در فرد مبتلا به خصیصه داسی‌شکل قبل از تداخل






شکل 2:a.  آزمایش داسی‌شدن در سلول‌های داسی بعد از تداخل با رقت 1:16 عصاره فلوس




شکل 2:b.  آزمایش داسی شدن در سلول‌های داسی بعد از تداخل با رقت 1:50 عصاره فلوس






شکل 2:c.  آزمایش داسی شدن در سلول‌های داسی بعد از تداخل با رقت 1:100 عصاره فلوس
 
بحث
کم‌‌خونی سلول داسی عارضه‌های مختلفی دارد که از جمله آن‌ها داسی‌شدن گلبول‌های قرمز خون، هماچوری، نکروز پاپیلاری کلیه، انفارکتوس طحال، وقایع ترومبوآمبولی وریدی و سندرم حاد قفسه سینه است (13). روش‌های مختلفی برای جلوگیری از این عوارض وجود دارد. طبق مطالعات متعدد، هیدروکسیل اوره به عنوان یک عامل کارآمد در محافظت از گلبول‌های قرمز خون در برابر داسی شدن در بیماران مبتلا به کم خونی سلول داسی شناخته شده است (16-14). استینبرگ و همکاران نشان دادند که مصرف هیدروکسیل اوره و بعد از آن افزایش سطح هموگلوبین جنینی (HbF) در بیماران مبتلا به کم‌خونی سلول داسی شکل باعث کاهش میزان مرگ و میر و کاهش حملات دردناک می‌شود (14). با این‌حال، درمان با هیدروکسیل اوره ممکن است برای همه بیماران قابل استفاده نباشد زیرا تعیین دوز آن دشوار است، استفاده از آن پرهزینه بوده و اثر سیتوتکسیک نیز دارد (17). از این رو تلاش‌ها برای یافتن درمان‌های جایگزین، ارزان‌تر و با سمیت کمتر برای مدیریت SCD، منجر به کشف خواص ضد داسی‌شدن گیاهان شد. از جمله گیاهان دارویی مورد استفاده در SCD، برگ Carica papaya است (18). بررسی‌های دیگر در کامرون، خواص ضد داسی گیاه Zanthoxyllum heitzii را تایید کرده‌ است و مشخص شده که میوه این گیاه بیشترین خاصیت ضد‌داسی را دارد (19). در این مطالعه به بررسی خاصیت ضد‌داسی میوه گیاه فلوس پرداختیم. این گیاه توسط جناب آقای دکتر محمد‌طه جلالی جهت این مطالعه، معرفی شده است. تیمار گلبول‌های قرمز با متابی سولفیت موجب افزایش داسی‌شدن می‌شود. زیرا متابی‌سولفیت سدیم شرایط هیپوکسیک را برای گلبول‌های قرمز ایجاد می‌کند که منجر به از دست دادن مورفولوژی و گلبول‌های قرمز داسی‌شکل می‌شود (20). فعالیت عصاره می‌تواند به دلیل وجود برخی از ترکیبات زیستی فعال آن‌ها باشد. غربالگری فیتوشیمیایی این عصاره‌ها ترکیباتی مانند فلاوونوئیدها، آنتراکوئینون‌ها و فورفورال را نشان داد که خاصیت ضد داسی دارند (5-3). فعالیت ضد داسی می‌تواند به توانایی آن‌ها در مهار پلیمریزاسیون آزمایشگاهی هموگلوبین یا برخی تغییرات ساختاری مرتبط با محیط هموگلوبین توسط عصاره‌ها مرتبط باشد (21). در مطالعه حاضر نشان داده شد که عصاره متانولی گیاه فلوس، تا رقت 1:100، در شرایط هیپوکسی اثر ضد داسی شدن بر سلول‌های خصیصه‌داسی شکل داشته است. در مطالعه‌ای که توسطA. Egunyomi و همکاران در سال 2009 انجام شد، از عصاره متانولی قسمت‌های مختلف 28 گیاه استفاده شد و فعالیت ضد داسی‌شدن آن‌ها بررسی شد. در این مطالعه از متا‌بی‌سولفیت‌سدیم برای القا داسی شدن شکل از HbSS در RBC استفاده کردند. عصاره‌ای که حاوی 28 گیاه به نام دستور 1 و عصاره دیگر حاوی 7 گیاه به نام دستور 2 بود. عصاره‌ها بعد از 180 دقیقه انکوباسیون، داسی شدن را به ترتیب به میزان 63/4‌% و 78/8‌% مهار کردند. یکی از گیاهان مورد استفاده در دستور 1، گیاه فلوس بوده است (22). بنابراین عصاره این گیاه در شرایط in vitro اثر ضدداسی شدن دارد و نیاز به مطالعات بیشتر جهت بررسی این اثر در شرایط in vivo است.
نتیجه‌گیری
به‌‌طور‌ کلی در مطالعه حاضر نشان داده شد که عصاره متانولی گیاه فلوس حتی با رقت 1:100 می‌تواند از داسی شدن سلول‌ها در شرایط in vitro جلوگیری کند. طبق مطالعات گذشته این گیاه مصارف مختلف درمانی داشته، دارای فعالیت بیولوژیکی در برابر تعدادی از بیماری‌ها شناخته شده است و فاقد سمیت می‌باشد. بنابراین این عصاره می‌تواند به عنوان یک داروی درمانی مفید و مقرون به صرفه، ابتدا از نظر ماهیت مکانیسم جلوگیری‌کننده از داسی شدن و بعد از آن در شرایط کلینیکی و in vivo، جهت کمک به افزایش امید به زندگی بیماران، تحت مطالعات بیشتری قرار گیرد.
سپاس‌گزاری
این مطالعه حاصل از طرح تحقیقاتی با شماره 90S3 بوده و توسط معاونت تحقیقات و فن‌آوری دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز پشتیبانی شده است.
حامی مالی: معاونت تحقیقات و فن‌آوری دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز
تعارض در منافع: وجود ندارد.
 

References:
 
1-    Hoffbrand V, Higgs DR, Keeling DM, Mehta AB, editors. Postgraduate Haematology. 7th ed. John Wiley & Sons; 2016.
2-    Telen MJ, Malik P, Vercellotti GM. Therapeutic Strategies for Sickle Cell Disease: Towards A Multi-Agent Approach. Nat Rev Drug Discov 2019; 18(2): 139-58.
3-    Luximon-Ramma A, Bahorun T, Soobrattee MA, Aruoma OI. Antioxidant Activities of Phenolic, Proanthocyanidin, and Flavonoid Components in Extracts of Cassia Fistula. J Agric Food Chem 2002; 50(18): 5042-7.
4-    Siddhuraju P, Mohan P, Becker K. Studies on the Antioxidant Activity of Indian Laburnum (Cassia Fistula L.): A Preliminary Assessment of Crude Extracts from Stem Bark, Leaves, Flowers and Fruit Pulp. Food Chemistry 2002; 79(1): 61-7.
5-    Patel A, Sindhu DK, Arora N, Singh RP, Pruthi V, Pruthi PA. Biodiesel Production from Non-Edible Lignocellulosic Biomass of Cassia Fistula L. Fruit Pulp Using Oleaginous Yeast Rhodosporidium Kratochvilovae HIMPA1. Bioresour Technol 2015; 197: 91-8.
6-    Tsaras G, Owusu-Ansah A, Boateng FO, Amoateng-Adjepong Y. Complications Associated with Sickle Cell Trait: A Brief Narrative Review. Am J Med 2009; 122(6): 507-12.
7-    Ilavarasan R, Malika M, Venkataraman S. Anti-Inflammatory and Antioxidant Activities of Cassia Fistula Linn Bark Extracts. Afr J Trad CAM 2005; 2(1): 70-85.
8-    Zargari A. Medicinal Plants. Vol 2. Tehran: Tehran University Publications 2014; 107-13. [Persian]
9-    Amin Gh. Medicinal and traditional plants of Iran. Research Institute of Iran medicinal plants 1992; 123. [Persian]
10-    Akhonzadeh Sh. Encyclopedia of Iranian Medicinal Plants. 1st. Tehran: Arjmand Publications 2000; 55. [Persian].
11-    Bhatnagar M, Vimal S, Vyas Y, Sharma D, Sharma K. Antioxidant Activity of Fruit Pulp Powder of Cassia Fistula. Pharmacognosy Journal 2010; 2(8): 219-28.
12-    Aynehchi Y. Pharmacognosy and medicinal plants of Iran. 1st. Tehran: Tehran University 1986; 1044. [Persian]
13-    Steinberg MH, Barton F, Castro O, Pegelow CH, Ballas SK, Kutlar A, et al. Effect of Hydroxyurea on Mortality and Morbidity in Adult Sickle Cell Anemia: Risks and Benefits Up to 9 Years of Treatment. JAMA 2003; 289(13): 1645-51.
14-    Teixeira SM, Cortellazzi LC, Grotto HZ. Effect of Hydroxyurea on G Gamma Chain Fetal Hemoglobin Synthesis by Sickle-Cell Disease Patients. Brazilian Journal of Medical and Biological Research 2003; 36: 1289-92.
15-    Ware RE, Zimmerman SA, Sylvestre PB, Mortier NA, Davis JS, Treem WR, et al. Prevention of Secondary Stroke and Resolution of Transfusional Iron Overload in Children with Sickle Cell Anemia Using Hydroxyurea and Phlebotomy. J Pediatr 2004; 145(3): 346-52.
16-    Charache S, Terrin ML, Moore RD, Dover GJ, Barton FB, Eckert SV, et al. Effect of Hydroxyurea on the Frequency of Painful Crises in Sickle Cell Anemia. N Eng J Med 1995; 332(20): 1317-22.
17-    gunyomi A, Moody J, Eletu O. Antisickling Activities of Two Ethnomedicinal Plant Recipes Used for The Management of Sickle Cell Anaemia in Ibadan, Nigeria. African Journal of Biotechnology. 2009; 8(1).
18-    Imaga NO, Gbenle GO, Okochi VI, Akanbi SO, Edeoghon SO, Oigbochie V, et al. Antisickling Property of Carica Papaya Leaf Extract. African Journal of Biochemistry Research 2009; 3(4): 102-6.
19-    Pauline N, Cabral BN, Anatole PC, Jocelyne AM, Bruno M, Jeanne NY. The in Vitro Antisickling and Antioxidant Effects of Aqueous Extracts Zanthoxyllum Heitzii on Sickle Cell Disorder. BMC Complement and Alternative Medicine 2013; 13(1): 1-7.
20-    Chikezie CP. Sodium Metabisulfite Induced Polymerization of Sickle Cell Hemoglobin Incubated in the Extracts of Three Medicinal Plants (Anacardium Occidentale, Psidium Guajava, and Terminalia Catappa). Pharmacogn Mag 2011; 7(26): 126-32.
21-    Bianchi N, Zuccato C, Lampronti I, Borgatti M, Gambari R. Fetal Hemoglobin Inducers from the Natural World: A Novel Approach for Identification of Drugs for the Treatment of Β-Thalassemia and Sickle-Cell Anemia. Evid Based Complement Alternat Med 2007; 6(2): 141-51.
22-     Egunyomi A, Moody JO, Eletu OM. Antisickling Activities of Two Ethnomedicinal Plant Recipes Used for the Management of Sickle Cell Anaemia in Ibadan, Nigeria.  African Journal of Biotechnology 2009; 8(1): 20-5.