ماهنامه علمی پ‍ژوهشی

مقدمه
خونریزی غیر طبیعی رحمی (Abnormal uterinebleeding (AUB)) در قالب مجموعه‌ای از عوامل شامل خونریزی شدید قاعدگی (Heavy menstrualbleeding(HMB))، خونریزی بین قاعدگی (Intermenstrual bleebing) و ترکیبی از خونریزی قاعدگی شدید و طولانی‌مدت توصیف می‌شود. بیماری خونریزی غیرطبیعی رحمی تحت شرایطی که با سرنام PALM-COEIN شناخته می‌شود، تشخیص داده می‌شود. PALM شامل پلیپ (Polyp)، آدنومیوزیز (Adenomyosis)، لیومیوم (Leiomyoma) و بدخیمی (Malignancy) و COEIN شامل اختلال انعقاد خون (Coagulopathy)، مشکلات تخمدانی (Ovulatory disorders)، اندومتریال (Endometrial)، مسائل یاتروژنیک (Iatrogenic) و مشکلات دسته‌بندی نشده (Not classified) است. باتوجه به شدت علائم بیماری روش‌ درمان دارویی یا جراحی در نظر گرفته می‌شود. درمان‌های دارویی در دو دسته داروهای هورمونی و غیر هورمونی دستهبندی می‌شوند. درمان‌های غیر هورمونی شامل آنتی‌فیبرینولیتیک‌ها و داروهای ضدالتهاب غیراستروئیدی (NSAIDs) هستند که حجم خونریزی را تا 50 درصد کاهش می‌دهند که البته در حضور پاتولوژی مشخصی مثل فیبروئیدهای رحمی اثر‌بخشی پایینی دارند. درمان‌های هورمونی شامل قرص‌های کانتراسپتیو خوراکی ترکیبی (COCP) و پروژسترون‌‌ها بسیار مورد استفاده هستند که عوارض جانبی مربوط به قرص‌های خوراکی مصرف طولانی‌مدت آن‌ها را محدود می‌کند. سیستم‌های درون رحمی شامل لوونورژسترل (LNG-Intra uterine system (LNG-IUS)) نیز ازجمله سیستم‌های اثربخش محسوب می‌شوند. اگرچه جای‌گذاری IUS درون رحم به‌خصوص در مواردی که جراحات ناشی از فیبروئیدهای زیر مخاطی وجود دارد و یا فیبروئیدها ساختار حفره رحمی را تغییر داده‌اند مشکل است. آگونیست‌های هورمون آزادکننده گنادوتروپین (GnRHa) در بیش از 90 درصد زنان منجر به آمنوره می‌شود. در موارد وجود فیبروئید، این درمان به‌طور مؤثری سایز فیبروئیدها را کاهش می‌دهد. البته عوارض جانبی همچون حالت هیپواستروژنیک متوجه افراد تحت درمان هست و نباید طول دوره مصرف طولانی شود (1). دارورسانی از طریق روت واژینال مزایای مختلفی چون مساحت سطح بالا، راحتی استعمال، عدم جذب ازطریق دستگاه گوارشی و حذف متابولیسم عبور اول کبدی، عروق خونی همگن و متراکم و در نتیجه وجود جریان خونی زیاد و نفوذپذیری مخاطی بالا را شامل می‌شود و بنابراین روت مناسبی برای دارورسانی به حساب می‌آید. دارورسانی واژینال از طریق فرمولاسیون‌های مختلف شامل میکروامولسیون‌ها، فوم‌ها، نیمه جامدات، قرص‌ها و تامپون‌ها انجام می‌شود. علی‌رغم طیف وسیع فرمولاسیون‌های رایج مورد استفاده در کاربردهای واژینال، رسانش مواد مؤثره دارویی از واژن به‌دلیل زمان ماندگاری پایین دارو در محیط واژن و عدم تنظیم جذب دارو در طول اپیتلیوم واژن همچنان چالش‌ برانگیز است. حلقه‌های واژینال نوعی سیستم‌ دارورسانی پلیمری هستند که قابلیت رهایش طولانی‌مدت یک یا چندین ماده مؤثره دارویی را درطول هفته‌‌ها و ماه‌ها ضمن ارائه خواص پایداری بهبود یافته دارو و عدم نشت دارو دارند. تاکنون هفت حلقه واژینال تجاری‌سازی شده‌اند که از این بین دو حلقه Nuvaring® و Ornibel® از پلیمر اتیلن‌وینیل‌استات و پنج حلقه Estring®، Femring®، Fertiring®، Progering® و Annovera® از الاستومرهای سیلیکون ساخته شده‌اند. حلقه‌های تجاری‌سازی شده نامبرده‌ قابلیت رهایش طولانی‌مدت ترکیبات استروئیدی را جهت کاربردهای هورمون درمانی جایگزین و پیشگیری از بارداری نشان داده‌اند. به‌علاوه نوعی حلقه واژینال رهایش دهنده داروی ضد ویروسی داپیویرین جهت پیشگیری از ابتلا به ویروس نقص سیستم ایمنی انسانی (HIV) در حال طی‌ کردن مراحل دریافت تأییدیه از آژانس دارویی اروپا (EMA) است. به ‌طورکلی تاکنون از الاستومرهای سیلیکون، اتیلن‌وینیل‌استات‌ها، پلی‌یورتان‌ها و پلیمرهای دیگری چون آکاسیا گام، هیدروکسی‌اتیل‌متاکریلات (HEMA)، سدیم متاکریلات (SMA) و هیدروژل پلی‌اکریلامید در ساخت حلقه‌های واژینال بهره گرفته شده است (3،2). با وجود طراحی‌های مختلف ارائه شده برای حلقه‌های واژینال دو نوع ماتریکسی (Matrix) و مخزنی (Reservoir) رایج‌ترین نوع طراحی به‌شمار می‌روند. در حلقه‌های ماتریکسی دارو به‌طور همگن درون ماتریس پلیمر پراکنده یا حل می‌شود و نفوذ دارو از حلقه کنترل‌کننده رهایش دارو است. نرخ رهایش دارو به چندین فاکتور شامل انحلال‌پذیری و ضریب نفوذ دارو در پلیمر، میزان بارگذاری دارو و مساحت سطح حلقه بستگی دارد. تماس حلقه با سیال واژن ابتدا منجر به رهایش داروی نزدیک به سطح حلقه می‌شود و سپس ناحیه تخلیه‌ای (depletion zone) ایجاد می‌شود که به سمت داخل حلقه حرکت می‌کند و در نتیجه نرخ رهایش دارو با گذشت زمان کاهش می‌یابد. در حلقه‌های ماتریسی رهایش دارو متناسب با مجذور زمان است. سیستم‌های مخزنی در قالب یک هسته حاوی دارو و غشایی پوشاننده که وظیفه رسانش دارو را دارد طراحی می‌شوند. میزان بارگذاری دارو درون هسته حلقه به حدی است که باعث حفظ محلول اشباع دارو در یک بازه زمانی مشخص می‌شود (4). در مطالعه‌ای که توسط لوکسلی و همکارانش در سال 2011 در کشور آمریکا انجام گرفته است، داروی ضدویروس UC781 و هورمون LNG به‌ترتیب به‌منظور پیشگیری از ابتلا به ویروس HIV و بارداری ناخواسته درون حلقه‌های واژینال ساخته شده از اتیلن‌وینیل‌استات بارگذاری شدند. طی نتیجه‌گیری انجام شده نرخ رهایش هر دارو با میزان بارگذاری دارو متناسب بوده و مستقل از داروی دیگر رهایش نشان داده است. هم چنین به مدت سه ماه در دمای 40 درجه سانتی‌گراد و میزان رطوبت 75 درصد پایدار بوده است (5). در مطالعه‌ای از بوید و همکارانش که در سال 2016 انجام گرفته است نیز هورمون LNG و داروی ضدویروس داپیویرین به‌طور همزمان به‌منظور پیشگیری از بارداری و ابتلا به HIV درون حلقه ماتریکسی سیلیکونی بارگذاری شدند و درطول دو بازه زمانی60 روزه برای حلقه ماتریسی و 180 روزه برای حلقه مخزنی رهایش پیوسته‌ای از خود نشان دادند (6). پدرو و همکارانش در سال 2012 در کشور آمریکا حلقه واژینال لود شده با داروی تنوفوویر دیزوپروکسیل فومارات جهت پیشگیری از ابتلا به HIV و ویروس هرپکس سیمپلکس (HSV) استفاده کردند و حلقه‌های طراحی شده بیش از یک میلی‌گرم در روز داروی مورد نظر را به مدت 30 روز رهایش دادند (7). در مطالعه دیگری که توسط مالکوم انجام شده است داروی nonoxynol-9  به منظور پیش گیری از HIV درون حلقه های واژینال ماتریکسی سیلیکونی لود شده است که با رهایش روزانه 2 میلی گرم در بازه زمانی 8 روزه، روش مؤثری معرفی شده است (8).
راهکار پیشنهادی ما در این پروژه برای درمان بیماری خونریزی غیرطبیعی رحمی، به‌کارگیری روش هورمون درمانی جایگزین است که به این منظور نوعی حلقه واژینال ماتریسی سیلیکونی (MatrixDispersion (MD)) طراحی شده و توسط قالب مناسب ساخته می‌شود. هورمون لوونورژسترل در پروسه ساخت حلقه به آن اضافه می‌شود. دراین مطالعه مشخصه‌یابی برون‌تنی 48 عدد حلقه سیلیکونی حاوی لوونورژسترل در محیط رهایش مناسب بررسی شده و نمونه بهینه مشخص شده است.
روش بررسی
طراحی و ساخت قالب
در مطالعه تجربی حاضر، برای ساخت حلقه واژینال از قالب دو قطعه‌ای آلومینیومی استفاده شده است که برای طراحی قالب، نرم افزار SolidWorks2014 به‌کار رفته است. بعد از اینکه طراحی قالب انجام شد، روی شمش آلومینیومی توسط دستگاه CNC حکاکی می‌شود و به‌منظور صیقلی شدن، سطح داخلی آن کاملاً پرداخت می‌شود. پرداخت قسمت‌های داخلی قالب از این جهت بسیار حائز اهمیت است که سیلیکون به سطح قالب نچسبد و از طرفی سطح حلقه کاملاً صاف باشد. چرا که ممکن است شیارهایی در اثر برش‌کاری قالب روی سطح حلقه ایجاد شود و روی ضخامت حلقه اثر بگذارد. برای ساخت حلقه ماتریسی حاوی لوونورژسترل از سیلیکون مایع دو جزئی XTX45 ساخت شرکت Zhermack ایتالیا استفاده شده است. جزء A آن، بخش پایه پلیمر و جزء B، بخش سفت کننده یا کراس لینک کننده پلیمر است که به پایه پلیمر اضافه می‌شود و با ایجاد پیوند بین زنجیره‌های پلیمری باعث سفت شدن پلیمر می‌شود. نسبت‌های مختلف دو جزء سیلیکون با هم ترکیب می‌شوند تا سیلیکون جامد با درجه نرمی مختلف ایجاد شود. پس از اینکه این دو بخش باهم مخلوط شدند، در دمای محیط حدود 1/5 ساعت برای انجام مراحل بعدی روی پلیمر قبل از قالب‌گیری زمان وجود دارد. در دمای محیط حدود 15 ساعت زمان برای سفت شدن پلیمر لازم است. دما روی سفت شدن پلیمر اثر مستقیم دارد. اگر درجه حرارت محیطی که در آن با این پلیمر کار می‌شود به 40 درجه سانتی‌گراد افزایش یابد، زمان‌های مذکور تقریباً نصف می‌شوند. بنابراین باید دمای محیط را به‌نحوی تنظیم کرد که با مشکلاتی همچون سفت شدن و غیرقابل استفاده شدن پلیمر برای قالب‌گیری مواجه نشد. برای ساخت حلقه ماتریسی حاوی داروی لوونورژسترل از روش قالب‌گیری تزریقی استفاده می‌شود. برای این‌کار ابتدا 10 گرم از جزء A پلیمر را در ظرفی ریخته و باتوجه به میزان سفتی مدنظر، جزء B به آن اضافه می‌شود. حال به میزان درصد مشخصی از وزن نهایی ترکیب (0/1، 0/2 یا 0/4 درصد)، به آن لوونورژسترل اضافه می‌گردد. ترکیب حاصل توسط همزن مکانیکی کاملاً ترکیب می‌شود تا یکنواخت شود. به‌دلیل ویسکوزیته بالای این ترکیب، هنگام هم‌زدن حباب‌های زیادی در آن ایجاد می‌شود که این حباب‌ها در بارگذاری و رهایش دارو اثرگذار است و باعث ایجاد تغییرات اساسی در خواص مکانیکی حلقه می‌شود، بنابراین باید این ترکیب قبل از تزریق حباب‌زدایی شود که به این منظور از آون خلأ استفاده گردید. پس از حباب‌زدایی، ترکیب پلیمر و دارو به قالب تزریق می‌شود. پلیمر باید به مدت 24 ساعت در دمای محیط قرار گیرد تا کاملاً سفت و از قالب جدا شود. در شکل (1) قسمت (A) دو نمونه از حلقه‌های MD ساخته شده به روش قالب‌گیری تزریقی و در قسمت (B) ابعاد حلقه پس از مرحله پخت نشان داده شده است. برای بررسی میزان اثرگذاری دما، rpm و محیط رهایش روی میزان رهایش دارو، در هریک از آزمایش‌ها دو سری حلقه مشابه با 8 درصد کراس لینکر و بارگذاری لوونورژسترل به میزان 0/2 درصد وزنی نسبت به سیلیکون درنظر گرفته شدند و رهایش دارو از آن‌ها به مدت 8 روز مورد بررسی قرار گرفت. برای بررسی اثر دما روی میزان رهایش، هر سری از حلقه‌ها در دو انکوباتور یکی با دمای 25 و دیگری 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. جهت بررسی rpm، هر سری از حلقه‌ها در دو انکوباتور یکی باrpm=80 و دیگری rpm=180 قرار گرفتند و برای بررسی اثر محیط رهایش، بافر سدیم استات mM 25 با pH= 4/5 یکی حاوی 10 و دیگری 25 درصد اتانول آماده سازی گردید و نمونه‌ها در انکوباتور با دمای 37 درجه و rpm=80 قرار داده شده و رهایش دارو از آن‌ها ارزیابی شد. جذب نوری از نمونه‌ها توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 247 نانومتر بررسی می‌شود. غلظت داروی آزاد شده در محیط رهایش را می‌توان به کمک جذب نوری بدست آمده و نمودار استاندارد رهایش به‌دست آورد.
 

شکل 1: نمونه‌ای از حلقه‌های MD ساخته شده به روش قالب‌گیری تزریقی (A) و ابعاد حلقه پس از مرحله پخت (B)
بررسی اثر دما، rpm و محیط رهایش روی میزان رهایش لوونورژسترل
 
بررسی سه بارگذاری اولیه مختلف روی میزان رهایش لوونورژسترل
برای انتخاب میزان بارگذاری اولیه بهینه جهت رسیدن به میزان رهایش در محدوده مورد نظر درمانی، سه سری حلقه حاوی 8 درصد کراس لینکر با بارگذاری‌های 0/1، 0/2 و 0/4 درصد وزنی لوونورژسترل نسبت به سیلیکون (wLNG/wSilicone) در 100 میلی‌لیتر بافر سدیم استات 25 میلی مولار با 5/4pH= و 10 درصد اتانول قرار می‌گیرد و سپس در شیکر انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‌گراد و rpm80 گذاشته می‌شود. نمونه‌گیری به‌صورت روزانه و به مدت 20 روز انجام می‌گیرد. محیط رهایش به‌صورت روزانه تعویض می‌شود. بررسی اثر کراس لینکر روی میزان رهایش لوونورژسترل از حلقه‌های MD
برای بررسی اثر کراس لینکر، حلقه‌های با درصدهای مختلف عامل کراس لینکر با مشخصات 100:5A:B=، 100:7A:B=، 100:8A:B=، 100:9A:B=، 100:9.5A:B= و 100:10A:B= ساخته شدند و تست رهایش روی آن‌ها انجام گرفت.
مدل ریاضی برای پیش‌بینی رهایش لوونورژسترل از حلقه‌های MD
برای پیش‌بینی رهایش یک داروی جامد که به‌صورت همگن در یک حلقه پلیمری ماتریسی حل شده است از معادله هیگوچی استفاده می‌شود (11، 10، 9) و طبق رابطهQ = [2(A-Cp)CpDpt]0.5 که درآن Q مقدار رهایش تجمعی دارو از واحد سطح حلقه (mg/cm2)، A میزان بارگذاری اولیه دارو در واحد حجم حلقه (mg/cm3)، Cp میزان حلالیت دارو در الاستومر سیلیکون (mg/cm3) و Dp ضریب نفوذ دارو در الاستومر سیلیکون (cm2/s) است، نمودار رهایش تجمعی لوونورژسترل برحسب مجذور زمان رسم شده و مقادیر ضریب نفوذ دارو محاسبه می‌شود.
آزمون تورم حلقه‌های MD
برای انجام تست تورم ابتدا وزن خشک (Wd) حلقه‌ها اندازه‌گیری می‌شود سپس حلقه‌ها در محیط رهایش بافر سدیم استات 25 میلی مولار با pH= 4/5 در شیکر انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‌گراد و rpm80 قرار می‌گیرند. روزانه به مدت یک هفته، حلقه‌ها از محیط رهایش خارج و خشک می‌شوند و توزین می‌شوند (Wf). میزان تورم حلقه‌ها طبق رابطه زیر محاسبه می‌شود:
= [(Wf-Wd)/Wf]*100        (1)درصد تورم
تجزیه و تحلیل آماری
بررسی آماری این مطالعه با آزمون همبستگی اسپیرمن (spearman correlation) انجام گرفته است. آنالیزها با نرم‌افزارversion 16  SPSS انجام شده و مقادیر P کمتر از 0/01 (P<0/01) به‌عنوان سطح معناداری درنظرگرفته شده است.
ملاحظات اخلاقی
پروپوزال این تحقیق توسط دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی تایید شده است (کد اخلاق SBMU.RETECH.REC.1395.21).
نتایج
شکل‌های (2)، (3) و (4) به‌ترتیب اثر دما، rpm و محیط رهایش روی رهایش لوونورژسترل از نمونه‌های 0/2 درصد وزنی لوونورژسترل به سیلیکون حاوی 8 درصد کراس لینکر نشان داده شده است. به ‌طور‌کلی جهت اعتبارپذیری نمونه‌ها از هر پروتوتایپ سه نمونه ساخته شده و سه بار آزمایش انجام گرفته است و نتیجه به‌عنوان میانگین این سه آزمایش گزارش شده است. همان‌طورکه در شکل‌ (2) مشهود است، دما اثر زیادی روی رهایش لوونورژسترل از حلقه‌های MD ندارد. باتوجه به اینکه دمای محیط واژینال همواره در حال تغییر است و تحت تأثیر عوامل مختلفی چون شرایط قاعدگی و تخمک‌گذاری تغییر می‌کند، این نتیجه نشان می‌دهد که پروفایل رهایش در اثر این تغییرات دمایی، تغییر شدیدی نخواهد داشت. هم‌چنین باتوجه به شکل (3) و نتایج حاصل از آزمایشات می‌توان rpm را یک فاکتور مؤثر در رهایش لوونورژسترل درنظر گرفت، به ‌این صورت که با افزایش rpm زهایش لوونورژسترل افزایش می‌یابد. بنابراین فاکتور rpm بایستی در بهینه سازی میزان رهایش دارو مورد توجه قرار گیرد. دراین پژوهش علی رغم بالاتر بودن میزان رهایش در حالت دور شیکر 180 از دور 80 استفاده می‌کنیم چراکه دراین حالت شرایط به محیط واژینال نزدیک‌تر بوده و نتایج منطقی تری حاصل می‌شود. برای بهینه‌سازی رهایش دارو باید به اثر محیط رهایش نیز توجه کرد. یکی از شرایطی که باعث افزایش رهایش دارو در محیط برون تنی می‌شود، افزایش حلالیت دارو در محیط رهایش است. سیلیکون پلیمری بسیار آبگریز است و ازطرفی محیط رهایش مورد استفاده (بافر سدیم استات) یک محیط آبی است. به همین دلیل نفوذ این محیط به داخل پلیمر برای اینکه دارو را در خود حل و از پلیمر خارج کند، خیلی پایین است. باتوجه به اینکه محیط واژینال یک محیط لیپوفیل است، برای شبیه‌تر شدن شرایط برون تنی به شرایط واقعی و افزایش رهایش دارو لازم است که حلال دارو به محیط رهایش اضافه شود. همان‌طورکه در نتایج حاصل از شکل (4) نیز مشخص است، افزایش اتانول به عنوان حلال لوونورژسترل موجب افزایش رهایش لوونورژسترل از حلقه MD می‌شود. اما به‌کارگیری در صدهای پایین‌تر اتانول محیط بافری را به سیال شبیه ساز واژن نزدیک‌تر نگه می‌دارد و ازاین‌رو 10 درصد اتانول به‌عنوان درصد مورد نظر انتخاب می‌شود. رابطه معنی‌دار بین میزان رهایش با rpm و نوع محیط رهایش با آزمون همبستگی اسپیرمن به اثبات رسیده است (P<0/01). باتوجه به نتایج حاصله دمای 37 درجه سانتی‌گراد، دور شیکر 80 و محیط رهایش حاوی 10 درصد اتانول به‌عنوان شرایط بهینه رهایش دارو درنظر گرفته شدند. از آنجاییکه برای رسیدن به رهایش بهینه می‌بایست گرادیان غلظت مناسبی ایجاد شود، انتخاب بارگذاری اولیه ازجمله مسائل حائز اهمیت است. بنابراین ابتدا میزان رهایش سه بارگذاری‌ 0/1، 0/2 و 0/4 درصد وزنی لوونورژسترل نسبت به سیلیکون را در شرایط دمای 37 درجه سانتی‌گراد، دور شیکر 80 و محیط رهایش حاوی 10 درصد اتانول بررسی می‌کنیم که در شکل (5) نتایج مربوط به آن آمده است.
 


شکل 2: اثر دما روی رهایش روزانه و تجمعی لوونورژسترل از حلقه‌های MD


شکل 3: اثر rpm روی رهایش روزانه و تجمعی لوونورژسترل از حلقه‌های MD



شکل 4: اثر محیط رهایش روی رهایش روزانه و تجمعی لوونورژسترل از حلقه‌های MD




شکل 5: اثر بارگذاری اولیه روی رهایش روزانه (A)، تجمعی (B) و درصد رهایش (C) لوونورژسترل از حلقه‌های MD با 8 درصد کراس لینکر
 
میانگین رهایش روزانه برای نمونه‌های 0/4، 0/2 و 0/1 درصد وزنی لوونورژسترل نسبت به سیلیکون و حاوی 8 درصد کراس لینکر به‌ترتیب برابر 122/18، 56/69 و 23/43 است. در بارگذاری 0/1 درصد وزنی لوونورژسترل نسبت به سیلیکون مشخص است که از روز دوازدهم میزان داروی آزاد شده به کمتر از 20 میکروگرم در روز می‌رسد و در روز بیستم صفر می‌شود. از طرفی در بارگذاری 0/4 درصد وزنی لوونورژسترل نسبت به سیلیکون رهایش تا روز بیستم همچنان درحدود 100 میکروگرم است که به مقدار زیادی از میزان مورد نظر بیشتر است. بنابراین همان‌طورکه مشاهده می‌شود، بارگذاری اولیه روی درصد لوونورژسترل آزاد شده تأثیرگذار است، به‌نحوی که در نمونه‌های با بارگذاری 0/4 و 0/2 درصد وزنی لوونورژسترل نسبت به سیلیکون پس از 20 روز به‌ترتیب 12 و 5/54 درصد از لوونورژسترل، اما در نمونه با بارگذاری 0/1 درصد وزنی لوونورژسترل نسبت به سیلیکون تنها 2/27 درصد از دارو آزاد شده است و رهایش روزانه نیز به صفر رسیده است و با توجه به آزمون همبستگی اسپیرمن، بین میزان بارگذاری اولیه دارو و رهایش آن همبستگی معنی‌داری (P<0/01) وجود دارد و با افزایش بارگذاری دارو رهایش نیز افزایش یافته است. میانگین رهایش روزانه نمونه 0/1 درصد وزنی لوونورژسترل به سیلیکون به مقدار مورد نظر 20 میکروگرم در روز نزدیک‌تر است اما از آنجاییکه از روز دوازدهم میزان رهایش به صفر می‌رسد نمونه قابل‌قبولی به ‌حساب نمی‌آید و نمونه 0/2 درصد وزنی لوونورژسترل به سیلیکون انتخاب مناسب‌تری به نظر می‌رسد. ابتدا در سه غلظت مختلف 0/1، 0/2 و 0/4 درصد وزنی لوونورژسترل نسبت به سیلیکون میزان رهایش را بررسی کردیم که نمودارهای مربوطه نیز ارائه شد و درنتیجه آن نمونه 0/2 درصد به‌عنوان درصد بارگذاری بهینه انتخاب شد. حال بارگذاری 0/2 درصد وزنی لوونورژسترل را روی 5 نسبت مختلف A:B بررسی می‌کنیم تا به درصد کراس لینکر مناسب برسیم. نتایج آزمون بررسی اثر کراس لینکر روی رهایش از حلقه‌های MD در شرایط مشخص دمای 37 درجه سانتی‌گراد، دور شیکر 80 و محیط رهایش حاوی 10 درصد اتانول در شکل (6) نمایش داده شده است. همه نمونه‌های مورد بررسی در روز اول یک رهایش انفجاری از خود نشان داده‌اند. این نتیجه نمایانگر این است که رهایش لوونورژسترل از سطح حلقه آغاز شده است و مقدار آن با درصد کراس لینکر رابطه معکوس دارد. معادله هیگوچی، رهایش دارو از یک ماتریس پلیمری زیست تخریب‌ناپذیر حاوی ذرات دارو را به‌صورت دیفیوژن توصیف می‌کند (12،13). براساس این معادله ابتدا داروهایی که در سطح پلیمر قرار دارند در محیط رهایش حل شده و آزاد می‌شوند که در این گام هیچ نفوذی صورت نگرفته است. در مرحله بعدی ذرات داروی پخش شده در سامانه پلیمری، می‌بایست ساختار شبکه کریستالی خود را ترک کرده و در ماتریس پلیمری حل شود (ناحیه انتشار)، سپس ازطریق نفوذ از ناحیه انتشار عبور کرده و وارد محیط رهایش شود. اگر فرآیند رهایش همچنان ادامه پیدا کند، ناحیه انتشار نیز گسترش پیدا می‌کند و ضخامت این لایه افزایش می‌یابد و متقابلا گرادیان غلظت کاهش می‌یابد. از آنجاییکه مقدار داروی بارگذاری شده بسیار بیشتر از مقدار اشباع لوونورژسترل در پلیمر و در محیط رهایش است، گرادیان غلظت نسبتا ثابتی ایجاد می‌کند و در نتیجه نرخ رهایش همه حلقه‌های مورد بررسی تقریبا مشابه است (10). در شکل (6) قسمت‌های A، B و C به‌ترتیب رهایش روزانه، تجمعی و درصد رهایش تجمعی لوونورژسترل از حلقه‌های با مقادیر مختلف کراس لینکر آورده شده است. همانطورکه از این نتایج مشخص است هرچه میزان کراس لینکر بیشتر باشد، رهایش لوونورژسترل کاهش می‌یابد. در ادامه درصد تورم در چهار حلقه MD با درصدهای مختلف عامل کراس لینکر با مشخصات 100:8A:B=، 100:9A:B=، 100:9.5A:B=، 100:10A:B= طبق معادله (1) بررسی شده است که نتایج آن در شکل (7) نشان داده شده است. همان‌طورکه از نتایج این تست مشخص است، میزان تورم و جذب آب به‌طور مستقیم به درصد کراس لینکر وابسته است. هرچه میزان کراس لینکر بیشتر باشد، سیلیکون سخت‌تر است و نفوذ محیط رهایش (محیط آبی) به آن کمتر است و در نتیجه طبق آزمون همبستگی اسپیرمن، همبستگی مشاهده شده در سطح معنی‌داری کمتر از 0/01 معنی‌دار است (P<0/01) و با افزایش میزان کراس لینکر درصد تورم کاهش می‌یابد. نمونه با 8 درصد کراس لینکر پس از 7 روز 4575/0 درصد متورم شده درحالیکه میزان تورم در نمونه با 10 درصد کراس لینکر 0/0359 درصد است. جذب عمده آب در روز اول رخ می‌دهد، سپس مقدار جذب آب تا روز سوم کاهش می‌یابد و تقریباً از روز چهارم به بعد صفر می‌شود و درواقع نوعی حالت تعادل بین حلقه و محیط رهایش ایجاد می‌گردد. درصد تورم در نمونه 100:9.5A:B= نسبت به نمونه‌های 100:8A:B= و 100:9A:B= کمتر است و ازاین‌رو نمونه مطلوب‌تری است.
 


شکل 6: اثر درصد کراس لینکر روی میزان رهایش روزانه (A)، تجمعی (B) و درصد رهایش (C) لوونورژسترل

 

شکل 7: درصد تورم حلقه‌های MD با درصدهای مختلف عامل کراس لینکر پس از یک هفته
 
بحث
دراین مطالعه درجهت درمان بیماری خونریزی غیر طبیعی رحمی حلقه‌های واژینال ماتریسی (MD) با قطر خارجی 54/99 میلی‌متر و ضخامت 5/99 میلی‌متر ساخته شدند و هورمون لوونورژسترل درون آن بارگذاری گردید. در حلقه‌های MD طراحی شده، رهایش در روز اول بصورت انفجاری است و از روز دوم با یک روند نزولی با گذشت زمان کاهش پیدا می‌کند بر خلاف حلقه‌های مخزنی طراحی شده در مطالعه قبلی این گروه که از روز دوم به یک نرخ رهایش تقریباً ثابت می‌رسیم و تا روز سی‌ام این نرخ همچنان ادامه دارد (14). در میان حلقه‌های با درصد کراس لینکر متفاوت به جز حلقه‌ با درصد کراس لینکر 10، بقیه حلقه‌ها روزانه بالای 20 میکروگرم لوونورژسترل آزاد کرده‌اند. در این حلقه بعد از حدود 25 روز رهایش دارو به صفر می‌رسد که البته این بازه از لحاظ درمانی قابل قبول است. مقدار بارگذاری اولیه لوونورژسترل در حلقه‌های با مقادیر متفاوت کراس لینکر برابر 22 میلی‌گرم بوده است و مقدار رهایش لوونورژسترل در روز اول برای حلقه‌های با درصد کراس لینکر 5، 7، 8، 9، 9/5 و 10 به‌ترتیب برابر 174/23، 159/29، 117/81، 104/54، 73/01 و 33/74 میکروگرم است و در روز سی‌ام برابر 44/25، 35/4، 24/89، 19/36، 6/64 و صفر میکروگرم حاصل شده است و بنابراین مقدار رهایش در روز اول بین 174/23-33/74 میکروگرم و در روز سی‌ام بین 44/25-6/64 میکروگرم است. شکل (8) بیانگر اهمیت بالای انتخاب درصد کراس لینکر مناسب است. طبق معادله (1)، یک رابطه خطی بین رهایش تجمعی دارو از حلقه (Q) و جذر زمان (t√) برقرار است که شیب آن برابر [(2A-Cp)CpDp]0.5 است. باتوجه به اینکه طبق رفرنس مقدار Cp  برابرmg/cm3  0/595 به‌دست آمده است (13)، مقدار ضریب نفوذ دارو در پلیمر (Dp) حاصل می‌شود. مقادیر ضریب نفوذ لوونورژسترل در حلقه‌های MD با درصدهای کراس لینکر 5، 7، 8، 9، 9/5 و 10 به‌ترتیب برابر 23/91، 14/81، 9/61، 6/61، 3/27 و 0/28 به‌دست آمده است. بنابراین همانطورکه در شکل (8) مشخص است هرچه مقدار کراس لینکر کمتر باشد، شیب خط حاصل بیشتر و در نتیجه ضریب نفوذ دارو در پلیمر بیشتر است. ازآنجاییکه نمونه 100:9.5A:B= دارای مقادیر رهایش در محدوده مورد نظر است به‌عنوان نمونه مورد نظر انتخاب می‌شود.
 

شکل 8: نمودار رهایش تجمعی لوونورژسترل برحسب مجذور زمان
 
در حلقه واژینال ماتریسی حاوی لوونورژسترل در مطالعه بوید و همکارانش باتوجه به دو مقدار بارگذاری اولیه 16 و 32 میلی‌گرم لوونورژسترل، مقدار رهایش آن در روز اول بین 684-129 و در روز شصتم بین 91-2 میکروگرم بوده است (6) و بنابراین نتایج به‌دست آمده در این پژوهش درمحدوده مورد انتظار بوده و قابل قبول است. در حلقه‌های با درصد کراس لینکر 5، 7، 8، 9، 9/5 و 10 به‌ترتیب 11، 9، 7، 5/9، 4 و 1/1 درصد از لوونورژسترل در بازه زمانی 30 روزه رهایش یافته است و میانگین رهایش روزانه در این حلقه‌ها به‌ترتیب 39/13 ± 79/13، 36/12 ± 63/95، 23/76 ± 48/30، 21/25 ± 41/50، 19/40 ± 29/28 و 8/49 ± 8/12 به‌دست آمده است که مطابق آزمون همبستگی اسپیرمن بین درصد کراس لینکر و رهایش روزانه لوونورژسترل همبستگی معنی‌داری در سطح معنی‌داری کمتر از 0/01 (P<0/01) برقرار است و با افزایش درصد کراس لینکر نرخ رهایش روزانه کاهش می‌یابد. میرنا نوعی سیستم دارورسانی درون رحمی دارای میزان بارگذاری 52 میلی‌گرم لوونورژسترل و رهایش روزانه 20 میکروگرم در یک بازه زمانی 5 ساله است که جهت پیشگیری از بارداری و درمان بیماری خونریزی غیرطبیعی رحمی مورد استفاده قرار می‌گیرد. پالاوی و همکارانش در مطالعه‌ای 70 زن 30 تا 55 ساله با بیماری خونریزی غیرطبیعی رحمی را به مدت 3 سال تحت درمان با میرنا قرار داده‌اند و نتایج مطالعه نشان‌دهنده کاهش 80 درصدی خونریزی در 4 ماهه اول درمان، 95 درصد کاهش طی یک سال اول و 100 درصد کاهش (قطع خونریزی) در 2 سال اول درمان بوده است (15). میانگین رهایش روزانه حلقه 100:9.5A:B= برابر 19/40 ± 29/28 میکروگرم بوده است که به مقدار رهایش روزانه سیستم درون رحمی تجاری شده میرنا نزدیک است. با این تفاوت که مقدار بارگذاری لوونورژسترل اولیه در سیستم میرنا برابر 52 میلی‌گرم و در حلقه‌های واژینال طراحی شده برابر 22 میلی‌گرم بوده است. در مطالعه‌ای که توسط نیو و همکارنش انجام گرفته جهت درمان اندومتریوزیس و پیشگیری از بارداری نوعی حلقه واژینال لود شده با دو داروی آناستروزول و لوونورژسترل طراحی شده است. برای همه نمونه‌های مورد آزمایش درطول 28 روز، نرخ رهایش پایدار لوونورژسترل مشاهده شده است و نزخ رهایش برون تنی واقعی اندکی از نرخ‌های رهایش اسمی (20، 30 و 40 میکروگرم در روز) بیشتر بوده است. در پایان مطالعه، دوز لوونورژسترل 40 میکروگرم در روز به‌عنوان غلظت میانگین درمقایسه با غلظت میانگین لوونورژسترل خوراکی 30 میکروگرم در روز به‌دست آمده در مطالعه رینک (16) درنظر گرفته شد (17).
نتیجه‌گیری
در خونریزی‌های غیرطبیعی رحمی از مشکلات شایع بین بانوان است که حدود 10 الی 30 درصد بانوان طی سال‌های باروری خود با آن مواجه می‌شوند. تاکنون روش‌های متعددی برای درمان این اختلال به‌کار رفته است که متداول‌ترین آن‌ها قرص‌های خوراکی هورمونی و IUD های هورمونی است. مهم‌ترین ویژگی مورد نیاز برای درمان خونریزی غیرطبیعی رحمی پیوسته بودن مصرف دارو در دوره درمان است. لذا IUD در قیاس با قرص، روش بهتری محسوب می‌شود. اما این روش نیز با مشکلاتی همراه است. به‌همین دلیل یک روش جایگزین مورد نیاز است که مانند IUD بتواند دارو را به‌صورت پیوسته آزاد کند و در عین حال مشکلات موجود را بر طرف نماید یا کاهش دهد. در این پژوهش سه غلظت مختلف دارو و پنج درصد مختلف کراس لینکر مورد بررسی قرار گرفته است و نمونه با بارگذاری مشخص 0/2 درصد وزنی لوونورژسترل نسبت به سیلیکون و دارای 9/5 درصد کراس لینکر به عنوان نمونه بهینه انتخاب گردیده است. حلقه‌های طراحی شده در این پژوهش قابلیت رهایش پیوسته‌ دارو در محیط واژینال در مدت زمان مورد نیاز را دارند و به‌عنوان یک حامل سیلیکونی داروی لوونورژسترل درجهت درمان خونریزی غیرطبیعی رحمی قابل ارائه هستند.
سپاس‌گزاری
محققین این پژوهش مراتب تشکر و قدردانی خود را از حمایت‌های مادی و معنوی مرکز تحقیقات پیشگیری از بیماری‌های زنان دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی و دانشکده علوم و فنون نوین دانشگاه تهران اعلام می‌دارد.
حامی مالی: این تحقیق با حمایت مالی مرکز تحقیقات پیشگیری از بیماری‌های زنان دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی طی قرارداد شماره 103/ز/95 به انجام رسیده است.
تعارض در منافع: وجود ندارد.
 

References:
 
1-    Cheong Y, Cameron IT, Critchley HO. Abnormal Uterine Bleeding. British Medical Bulletin 2017; 123(1): 103-14.
2-    Malcolm RK, Boyd PJ, Mccoy CF, Murphy DJ. Microbicide Vaginal Rings: Technological Challenges and Clinical Development. Advanced Drug Delivery Reviews 2016; 103: 33-56.
3-    Sharifzadeh G, Hezaveh H, Muhamad II, Hashim S, Khairuddin N. Montmorillonite-Based Polyacrylamide Hydrogel Rings for Controlled Vaginal Drug Delivery. Materials Science and Engineering: C 2020; 110: 110609.
4-    Externbrink A, Eggenreich K, Eder S, Mohr S, Nickisch K, Klein S. Development and Evaluation of Accelerated Drug Release Testing Methods for a Matrix-Type Intravaginal Ring. European J Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2017; 110: 1-12.
5-    Loxley A, Mitchnick M, Okoh O, Mcconnell J, Goldman L, Morgan C, et al. Ethylene Vinyl Acetate Intravaginal Rings for the Simultaneous Delivery of the Antiretroviral UC781 and Contraceptive Levonorgestrel. Drug Deliv Trans Res 2011; 1(3): 247-55.
6-    Boyd P, Fetherston SM, Mccoy CF, Major I, Murphy DJ, Kumar S, et al. Matrix and Reservoir-Type Multipurpose Vaginal Rings for Controlled Release of Dapivirine and Levonorgestrel. Int J Pharm 2016; 511(1): 619-29.
7-    Mesquita PM, Rastogi R, Segarra TJ, Teller RS, Torres NM, Huber AM, et al. Intravaginal Ring Delivery of Tenofovir Disoproxil Fumarate for Prevention of HIV and Herpes Simplex Virus Infection. J Antimicrob Chemother 2012; 67(7): 1730-8.
8-    Malcolm K, Woolfson D, Russell J, Andrews C. In Vitro Release of Nonoxynol-9 from Silicone Matrix Intravaginal Rings. J Control Release 2003; 91(3): 355-64.
9-    Taghizadeh SM, Mashak A, Jamshidi A, Imani M. Study of Progesterone Release Mechanisms from a Silicone Matrix by a New Analytical Method. J Applied Polymer Science 2004; 12(5): 407-12.
10-    Tojo K. Intrinsic Release Rate from Matrix-Type Drug Delivery Systems. J Pharm Sci 1985; 74(6): 685-7.
11-    Snorradóttir BS, Jónsdóttir F, Sigurdsson ST, Thorsteinsson F, Másson M. Numerical Modelling and Experimental Investigation of Drug Release from Layered Silicone Matrix Systems. Eur J Pharm Sci 2013; 49(4): 671-8.
12-    Higuchi T. Mechanism of Sustained Action Medication. Theoretical Analysis of Rate of Release of Solid Drugs Dispersed in Solid Matrices. J Pharm Sci 1963; 52: 1145-9.
13-    Theeuwes F, Hussain A, Higuchi T. Quantitative Analytical Method for Determination of Drugs Dispersed in Polymers Using Differential Scanning Calorimetry. J Pharm  Sci 1974; 63(3): 427-9.
14-    Hosseinzade F, Tabesh H, Farzaneh F. Fabrication of a Reservoir Ring for Sustained and Prolonged Release of Levonorgestrel for Vaginal Administration. JSSU 2020, 28(9): 3044-55. [Persian].
15-    Dhamangaonkar PC, Anuradha K, Saxena A. Levonorgestrel Intrauterine System (Mirena): An Emerging Tool for Conservative Treatment of Abnormal Uterine Bleeding. J MidLife Health. 2015; 6(1): 26-30.
16-    Reinecke I, Schultze‐Mosgau MH, Nave R, Schmitz H, Ploeger BA. Model Based Dose Selection For Intravaginal Ring Formulations Releasing Anastrozole and Levonorgestrel Intended for the Treatment of Endometriosis Symptoms. J Clin Pharmacol 2017; 57(5): 640-51.
17-    Nave R. Development of an Intravaginal Ring Delivering Simultaneously Anastrozole and Levonorgestrel: A Pharmacokinetic Perspective. Drug Deliv 2019; 26(1): 586-94