دوره 30، شماره 3 - ( خرداد 1401 )                   جلد 30 شماره 3 صفحات 4669-4656 | برگشت به فهرست نسخه ها


XML English Abstract Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Darvishi E, Amani A, Mirsadeghi S, Shiri Varnamkhasti B. Synthesis and Evaluation of Gold Nanoparticles/Nanorods to Use in Plasmonic Photothermal Therapy. JSSU. 2022; 30 (3) :4656-4669
URL: http://jssu.ssu.ac.ir/article-1-5274-fa.html
درویشی الهه، امانی اسرا، میرصادقی سمیه، شیری ورنامخواستی بهرنگ. سنتز و ارزیابی نانو ذرات نانو میله‌های طلا جهت استفاده در روش پلاسمونیک فوتوترمال‌تراپی (گرما درمانی نوری). مجله علمي پژوهشي دانشگاه علوم پزشكي شهید صدوقی يزد. 1401; 30 (3) :4669-4656

URL: http://jssu.ssu.ac.ir/article-1-5274-fa.html


متن کامل [PDF 1062 kb]   (141 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (214 مشاهده)
متن کامل:   (112 مشاهده)
مقدمه
امروزه استفاده از فناوری نانو به منظور درمان و تشخیص انواع بیماری‌ها از جمله سرطان‌ها بسیار مورد توجه قرار گرفته است. فناوری نانو بر روش‌های نوین و جایگزین درمان‌های معمولی و افزایش کارآمدی آن‌ها در درمان سرطان تمرکز دارد (2,‌1). امروزه به دلیل شیوع بالای بیماری سرطان نیاز به روش¬های درمانی نوین و کارآمد بسیار احساس می‌شود. فناوری نانو می‌تواند در این زمینه بسیار کمک کننده باشد. با توسعه قابل‌توجه فناوری نانو در سال‌های اخیر، استفاده از نانوذرات مختلف در روش‌های تشخیصی، تولید کیت و زیست‌حسگرها، تصویربرداری مغناطیسی، فتوترمال تراپی، دارورسانی نوین و هدفمند و ... بسیار مورد استفاده قرار گرفته‌اند. دستاوردهای اخیر نشان می‌دهد که نانوذرات می‌توانند در زمینه‌های مختلف تشخیصی و درمانی تاثیر بسزایی داشته باشند. در حال حاظر این فناوری متمرکز بر روش‌های نوین و در حال توسعه پیشگیری، تشخیص و درمان بیماری‌های مختلف به‌ویژه سرطان می‌باشد. یکی از این روش‌های درمانی، فتوترمال‌تراپی است (4,‌3). فوتوترمال‌تراپی (PTT) یک روش درمانی با کمترین تهاجم (مسلماً در صورت عدم کنترل بر روی تابش لیزر، احتمال آسیب به سلول‌های نرمال هم وجود دارد، که با تنظیم شدت لیزر، مدت زمان تابش آن و استفاده از نانوذرات مناسب از عوارض جانبی روش کاهش می‌یابد) است که در آن انرژی فوتون‌ها به انرژی گرمایی تبدیل می‌شود تا هایپرترمیا سلولی القاء شود. پلاسمونیک فوتوترمال‌تراپی به همراه نانوذرات فلزی طلا یک روش جدید و کارآمد برای مقابله با سلول‌های سرطانی است. این روش به دو صورت آپوپتوز و نکروز و به دلیل ایجاد گرما از رشد سلول‌های سرطانی جلوگیری می‌کند و در نهایت آن‌ها را از بین می‌برد. در عین حال به دلیل خواص پلاسمونیک نانوذرات طلا، این ترکیبات به عنوان عوامل کنتراست برای شناسایی زودهنگام بیماری‌‌ها نیز کاربرد دارند (6,‌5). مطالعات بر روی کاربرد PTT، نشان دادند که کنترل موضعی تومور و زمان بقاء در مدل‌های حیوانی، به مقدار قابل‌توجهی بهبود یافته است. از سوی دیگر از جذب پلاسمون سطحی نانوگیج‌های طلا در تصویربرداری تشخیصی و درمان in vitro استفاده شده است (6). طلا به علت خنثی و زیست‌سازگار بودن و هم‌چنین آسان بودن پوشش‌دار کردن سطح آن در پزشکی کاربردهای زیادی دارد. (8,‌7,‌5). به دلیل خواص و مزایای ذکر شده در مورد نانوذرات طلا، دستیابی به روش مؤثر برای مقابله با رشد سلول‌های سرطانی با استفاده از نانوذرات طلا کنژوگه شده با  ترکیبات متفاوت و کاهش عوارض جانبی، هدف این تحقیق بوده است.
روش بررسی
2-1 مواد
به منظور سنتز و بررسی نانوذرات طلا، نمک کلرید طلای سه آبه (HAuCl4.3H2O) و ستیل‌‌تری‌متیل آمونیوم بروماید (CTAB) از شرکت Merk  تهیه شد. هم‌چنین سدیم بوروهیدرید، آسکوربیک اسید، ریفامپیسین و Querctin از شرکت Sigma خریداری شدند. به منظور کشت سلول و بررسی سمیت سلولی نیز سرم آلبومین گاوی (BSA)، Cell Culture, Classic Media and Salts, RPMI- 1640 هم از شرکت Sigma تهیه شد. رده‌های سلولی سرطانی MCF-7 نیز از انستیتو پاستور خریداری شد.
2-2 سنتز نانو‌ذرات کروی و میله‌ای طلا
روش مورد استفاده برای سنتز نانو ذرات در این تحقیق روش دانه‌گذاری  Seedingاست. دانه، به عنوان هسته اولیه برای شروع واکنش عمل می‌کند. نانو‌ذراتی که به این روش تهیه می‌شوند، دارای پوشش  Cetyltrimetylammonium bromide (CTAB) هستند، این پوشش به عنوان یک پایدارکننده برای نانو‌ذرات عمل می‌کند. CTAB به صورت دو لایه با دو سر هیدروفوب و هیدروفیل سطح نانو‌ذره را می-پوشاند و به همین دلیل نانو ذرات طلا با پوشش CTAB توانایی واکنش با هر دو ترکیب هیدروفوب و هیدروفیل را دارند.
2-2-1 سنتز seed
مهم‌ترین بخش سنتز نانوذرات طلا، سنتز seed است، اگه seed  درست سنتز شود، مشکلی در تهیه نانوذرات میله‌ای به وجود نمی‌آید، برای سنتز seed، محلول M 0/1 از CTAB در ظرف سنتز ریخته شد (این ظرف باید تنها برای سنتز seed استفاده شود) و µL250 محلول نمک طلای M 0/01 اضافه کرده و به مدت 10 دقیقه بر روی استیرر قرار داده شد. سپس محلول M0/01 از سدیم بوروهیدرید تهیه و آنقدر از محلول سدیم بوروهیدرید به محلول قبلی اضافه می‌شود که رنگ آن طلایی مایل به قهوه‌ای باشد. بعد از تشخیص رنگ درست، محلول به مدت 15 دقیقه با سرعت بالا همزده شد، سپس با سرعت rpm200 حدود 2 تا 5 ساعت بعد محلول seed قابل استفاده است.
2-2-2 سنتز نانوذرات کروی
cc45 محلول رشد (cc36 CTAB+ AU cc 1/125+ آب مقطر برای رسیدن به حجم cc 45)، اسید اکسوربیک µL250 (غلظت M 0/1) و در نهایت µL50  از محلول seed با هم ترکیب شده و چند دقیقه روی استیرر قرار داده شد، بعد از چند دقیقه محلول در جایی که ثابت باشد نگهداری شده تا تغییر رنگ کامل شود، رنگ محلول از قرمز شرابی تا صورتی پر رنگ با توجه به سایز آن متغیر است. بعد از شستشوی محلول از آن طیف UV گرفته شد که یک پیک شارپ بین 520 تا 530 باید دیده شود.
2-2-3 سنتز نانوذرات میله‌ای
cc10 محلول CTAB به همره µL100 محلول M 0/01 از نیترات نقره حدوداً 20 دقیقه به همراه هم بر روی استیرر هم خورده، بعد از آن µL500 محلول نمک طلا به آن اضافه شد و دوباره اجازه داده شد محلول به مدت 20 دقیقه دیگر نیز هم بخورد، سپس µL70 آسکوربیک اسید M0/1 به آن‌ها اضافه گردید و به مدت 5 دقیقه همزدن ادامه پیدا کرد، در پایان µL12 از محلول seed به محلول اضافه شده و تغییر رنگ در جایی که هیچ تکانی ندارد قرار داده شد. رنگ محلول تقریباً قهوه‌ای تیره مایل به سیاه است، هر رنگ دیگری مثل رنگ‌های با تم بنفش تیره، یعنی سنتز درست انجام نشده است و ترکیب مخلوطی از کروی و میله¬ای خواهد بود. شستشو نانوذرات با آب مقطر بعد از 24 ساعت و سه بار صورت گرفت سپس طیف UV آن‌ها گرفته شد.
2-2-4 بررسی خصوصیات فیزیکوشیمیایی بعد از سنتر،
خصوصیات فیزیکی و شیمیایی نانوذرات کروی و نانومیله‌های طلا به روش (DLS) Dynamic Light Scattering ، UV-Vis و (TEM) Transmission Electron Microscopy  مورد بررسی قرار گرفت.
2-2-5 تعیین غلظت نانوذرات سنتز شده
به منظور تعیین غلظت نانوذرات طلا کروی و میله‌ای سنتز شده، از دستگاه طیف‌سنج جذب اتمی با روش آزمون/ شماره استاندارد ISIRI-8523 استفاده شد. بدین منظور غلظت‌‌های مختلف طلا تهیه شد و سپس غلظت محلول حاوی نانوذرات مورد نظر برحسب ppm or mg/L)) به دست آمد.
 




شکل 1: تغییر رنگ محلول‌های حاوی نانوذرات طلا A) محلول seed B) نانوذرات کروی C) نانوذرات میله‌ای


جدول 2-3: غلظت نانوذرات طلا کروی و میله‌ای سنتز شده با استفاده از دستگاه  طیف‌سنج جذب اتمی



 
2-3 آماده‌سازی نانوذرات به منظور استفاده از آن‌ها در PPTT
2-3-1 تهیه کنژوگه نانوذره-سرم آلبومین گاوی (BSA)؛ استفاده از BSA به منظور جلوگیری از واکنش‌های ناخواسته انجام می‌شود. بدین منظور از 50 میلی‌لیتر محلول 5 میلی‌مولار BSA با 1 نانومولار نانوذره به مدت 10 ساعت در دمای اتاق انکوبه شد. سپس اضافی BSA توسط سانتریفیوژ جدا گردید.
2-3-2 سپس به ترکیب NPs-BSA، 1 میلی‌لیتر(RGD) Arginylglycylasparic acid (CGPDGRDGRDGRDGR) (Genscript) با غلظت 5 میلی‌مولار اضافه گردید. این ترکیب سبب می‌شود، اندوسایتوز به‌واسطه اینتگرین Integrin فعال شود.
2-3-3 به محلول NPs-BSA-RGD، 5 میلی‌لیتر داروی ریفامپیسین (RF) با غلظت 5 میلی‌مولار اضافه شد، این دارو به عنوان مهارکننده اگزوسایتوز عمل می‌کند. ترکیب NPs-BSA-RGD به همراه RF در دمای اتاق به مدت 5 ساعت انکوبه شده و سپس برای جدا‌کردن مقدار اضافی RF سانتریفیوژ انجام گرفت.
2-3-4 تعیین خصوصیات ترکیب NPs-BSA-RGD-RF توسط UV-Vis، RF در دو طول موج nm470 و nm330 جذب دارد وقتی با NPs ترکیب می‌شود جذب در این دو ناحیه در طیف جذبی طلا نیز دیده می‌شود که ثابت می‌کند طلا و ریفامپیسین با هم واکنش داده‌اند.
2-3-5 سپس Quercetin (به عنوان بازدارنده HSPs عمل می‌کند) با حجم 5 میلی‌لیتر و غلظت 5 میلی‌مولار غلظت مناسب اضافه شد و ترکیب به مدت 5 ساعت در دمای اتاق به آهستگی هم‌ زده شد، QE در nm370 جذب دارد. برای تأیید تشکیل کنژوگه QE-NPs از UV-Vis استفاده می‌شود. نانوذره طلا کنژوگه شده، برای جدا‌کردن مولکول QE واکنش نداده، سانتریفیوژ می‌‌شود.
2-4 آزمون سنجش میزان سمیت سلولی
جهت کنترل وضعیت سلول‌ها در محیط کشت، میزان بقا و هم‌چنین بررسی وضعیت سلول‌ها بعد از تیمار آن‌ها با نانوذرات از روش MTT استفاده شد. آزمایش MTTیک روش رنگ سنجی است که بر اساس احیا شدن و شکسته شدن کریستال‌های زرد رنگ تترازولیوم به‌وسیله آنزیم سوکسینات دهیدروژناز موجود در میتوکندری فعال سلول¬های زنده و تشکیل کریستال‌های آبی رنگ نامحلول انجام می‌شود. سپس کریستال‌های تشکیل شده در DMSO (Dimethyl sulfoxide) حل شده و شدت جذب نوری محلول رنگی حاصله توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر و در طول موج 570 نانومتر اندازه گیری می‌شود (9,10).کاهش تعداد سلول‌های زنده در نمونه آزمایش منجر به افت فعالیت متابولیکی کل آن گردیده و این کاهش مستقیماً با میزان تشکیل کریستال‌های بنفش رنگ مرتبط است که میزان فعالیت میتوکندری و در نتیجه میزان زنده یا مرده بودن سلول‌ها را نشان می‌دهد
2-4-1 تهیه محلول رنگ  MTT
این محلول از انحلال 0/5 گرم MTT در 100 میلی لیتر بافر فسفات سالین تهیه شد. پس از تهیه باید در ظرف با پوشش آلومینیومی و در دمای20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شود.
2-4-2 نحوه اثر دادن نانوذرات
به منظور بررسی میزان اثر سایتوتوکسیسیتی نانوذرات در محیط برون تن، پس از کشت رده‌ سلولی‌ MCF-7 و رسیدن به تراکم مناسب سلولی، سلول‌ها در پلیت 96 خانه ای به ازای هر خانه 103×5 سلول کاشته شد و یک روز پس از کشت سلول‌ها با غلظت‌های مختلفی (1 تا 320 میکروگرم بر میلی-لیتر) از نانوذرات کروی و میله‌ای، داروی سیس‌پلاتین به عنوان کنترل مثبت و محیط کشت بدون دارو به عنوان کنترل منفی تیمار شدند. نتایج حاصل از تست MTT پس از 24 و 48 ساعت از تیمار سلول‌ها بررسی شد و درصد viability به دست آمد و مقدار ic50 با استفاده از نرم‌افزار prism محاسبه گردید. داده‌ها به صورت عدد متوسط انحراف از معیار گزارش شده‌اند. تفاوت¬ها از طریق آزمون تحلیل واریانس (Analysis of variance (ANOVA))با استفاده از نرم‌افزارSPSS version 16 مقایسه و وجود یا عدم وجود تفاوت معنی¬دار بین آن‌ها مشخص شد.
تجزیه و تحلیل آماری
داده‌ها به صورت عدد متوسط انحراف از معیار گزارش شده‌اند. تفاوت‌ها از طریق آزمون تحلیل واریانس (Analysis of variance (ANOVA)) با استفاده از نرم افزارSPSS version 16 مقایسه و وجود یا عدم وجود تفاوت معنی‌دار بین آن‌ها مشخص شد.
ملاحظات اخلاقی
پروپوزال این تحقیق توسط دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه تایید شده است (IR.KUMS.REC.1397.354).
نتایج
3-1 طیف‌سنجی مرئی – فرابنفش نانوذرات کروی و میله‌ای
اولین آنالیزی که برای تایید سنتز صحیح نانوذرات کروی و میله‌ای طلا انجام گرفت، طیف‌سنجی مرئی‌ فرابنفش نانوذرات بود. بعد از شستشوی کامل نانوذرات با آب مقطر، از آن طیف UV گرفته شد در مورد نانوذرات کروی طلا، همانطور که در شکل 2 قسمت A مشاهده می‌شود، یک پیک شارپ بین 535 دیده شد که تایید کننده سنتز نانوذرات کروی به طور صحیح است و با تحقیقات سایر محققین نیز مطابقت دارد (11,12). در طیف UV نانوذرات میله‌ای طلا باید دو پیک مشاهده شود. پیک اولی کوچک و در ناحیه 520 تا 530 قرار دارد که مربوط به عرض نانوذره است و پیک بعدی یک پیک شارپ در ناحیه بالای 700 نانومتر است که مربوط به طول نانوذره است. اگر اختلاف جذب دو پیک کم باشد نشان دهنده وجود نانوذرات کروی در محلول نانوذرات میله‌ای است. اگر دو پیک درست پشت سر هم باشند یعنی AR (aspect ratio) پایین است که هر کدام از این موارد نشان‌دهنده نامناسب بودن ترکیب سنتز شده خواهند بود (15-13). اما با توجه به شکل2 قسمتB پیک کوچک در محدوده 523 نانومتر و پیک بزرگ در محدوده 738 نانومتر مشاهده می‌شود که نشان دهنده سنتز صحیح و بدون ناخالصی و با سایز و AR درست می‌باشد. نتایج به دست آمده در این آنالیز مشابه نتایج سایر محقیقین می‌باشد به عنوان نمونه مشابه تحقیقات Sayed و همکاران در سال 2010 و هم‌چنین Amini و همکاران در سال 2018 می‌باشد (16,‌15).
3-2 نتایج بررسی اندازه ذرات و شاخص پراکندگی اندازه نانوذرات Poly dispersity index (PDI)
به منظور تعیین حدودی اندازه نانوذرات از آنالیز Dynamic light scattering DLS استفاده شد. در این آنالیز شعاع هیدرودینامیکی نانوذرات و شاخص پراکندگی اندازه آن‌ها (PDI) به دست آمد (شکل3). نتایج به دست آمده نشان داد که نانوذرات کروی دارای شعاع هیدرودینامیکی 95/22 نانومتر بوده و شاخص پراکندگی اندازه ذرات 0/257 بود که بسیار مناسب بوده و نشان دهنده سنتز نانوذرات همگن و با اندازه یکنواخت است (شکل 3A). هم‌چنین در مورد نانوذرات میله‌ای (شکل3B) دو پیک مشاهده شد که با نتایج حاصل از تحقیقات سایر محققین کاملاً مطابقت داشت (19-17). Liu و همکاران در سال 2012 در مقاله خود به بررسی نانوذرات طلا میله‌ای شکل با سایزهای متفاوت توسط DLS پرداخت که نتایج مشابهی با این تحقیق گزارش کرد و حضور دو پیک را در این آنالیز به خوبی نشان داد (19). برای بررسی سایز دقیق نانوذرات از دستگاه میکروسکوپ الکترونی عبوری استفاده شد.
3-3 نتایج بررسی نانوذرات با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM)
اساس عملکرد میکروسکوپ انتقال الکترونی(Transmission Electron Microscope)  که به اختصار به آن TEM می‌گویند مشابه میکروسکوپ‌های نوری است با این تفاوت که به جای پرتوی نور در آن از پرتوی الکترون استفاده می‌شود. آنچه که می‌توان با کمک میکروسکوپ نوری مشاهده کرده بسیار محدود است در حالیکه با استفاده از الکترون‌ها به جای نور، این محدودیت از بین می‌رود. وضوح تصویر در TEM هزار برابر بیشتر از یک میکروسکوپ نوری است (20). برای بزرگ‌نمایی، TEM ابزار مناسبی است که هم در تحقیقات پزشکی، بیولوژیکی و هم در تحقیقات مرتبط با مواد قابل استفاده است. وضوح این میکروسکوپ 0/2 نانومتر است که در حد اتم است. با این نوع میکروسکوپ حتی می‌توان نحوه قرار گرفتن اتم‌ها در یک ماده را بررسی کرد. تصویر میکروسکوپ الکترونی عبوری نانوذرات کروی و میله‌ای سنتز شده در شکل 4 و 5 نشان داده شده است. در شکل 4 مرفولوژی کروی نانوذرات با سایز حدود 21 نانومتر قابل مشاهده است. هم‌چنین در شکل 5 مرفولوژی میله‌ای نانوذرات به درستی مشخص است. همان‌طور که از تصاویر مربوط به نانوذرات میله¬ای مشخص است، نانوذرات خالص (اشکال دیگر نانوذرات مشاهده نشد) و با AR~4 می‌باشند. در هر دو مورد نانوذرات کروی و میله‌ای طلا، تصاویر ثبت شده نشان دهنده این است که نانوذرات سنتز شده، از پراکندگی مناسبی برخوردار هستند.
 




شکل 2: طیف‌ مرئی – فرابنفش نانوذرات  (A طلا کروی (B طلا میله‌ای



شکل3: توزیع اندازه ذرات (A طلا کروی (B طلا میله‌ای به دست آمده توسط دستگاه زتا سایزر در شرایط بهینه



شکل4: تصاویر TEM نانوذرات کروی طلا


شکل5: تصاویر  TEMنانوذرات میله‌ای طلا
 
3-4 خصوصیات نانوذرات سنتز شده به منظور استفاده از آن‌ها در PPTT
3-4-1 طیف سنجی مرئی فرابنفش NPs-RF
ریفامپیسین (RF) در دو طول موج nm470 و nm330 جذب دارد وقتی با NPs ترکیب می‌شود جذب در این دو ناحیه در طیف جذبی طلا برای نانوذرات کروی (2 پیک) و نانوذرات کروی (1 پیک) نیز دیده می‌شود که ثابت می‌کند طلا و ریفامپیسین با هم واکنش داده‌اند (21). با توجه به شکل 6 پیک‌های مربوط به ریفامپیسین و نانوذرات کروی و میله‌‌ای طلا در کنژوگه NPs-RF قابل مشاهده است که نشان دهنده واکنش میان نانوذرات میله‌ای و کروی طلا با ریفامپیسین بوده و سنتز صحیح کنژوگه NPs-RF می‌باشد.
2-3-5-5 Quercetin (به عنوان بازدارنده HSPs عمل می‌کند) با غلظت مناسب اضافه شد و ترکیب به مدت 5 ساعت در دمای اتاق به آهستگی هم‌ زده شد، QE در nm370 جذب دارد. استفاده از نانوذرات کنژوگه شده با مهار کننده های HSP70 می‌توانند اثرPPTT  را بیشتر کند. از آنجا که کوئرستین (QE) یک مهار کننده امیدوارکننده HSP70 است، نانوذرات با QE کنژوگه شدند. برای تأیید تشکیل کنژوگه QE-NPs از UV-Vis استفاده می‌شود. لازم به ذکر است که QE به تنهایی در طول موج 370 نانومتر جذب دارد. نانوذرات به تنهایی قبل از کنژوگه شدن باQE ، پیکی در 370 نانومتر را نشان نمی‌دهند، با این حال پس از کنژوگه شدن با QE نمایش یک پیک در 370 نانومتر را نشان می‌دهد که ترکیب QE را با نانوذرات تأیید می‌کند. این نتایج با نتایج تحقیقات Moustafa R.K و همکاران در سال 2016 مطابقت دارد (21).
 



شکل 6: طیف‌سنجی مرئی فرابنفش (A): نانوذرات میله‌ای طلا- ریفامپیسین، (B): نانوذرات کروی طلا- ریفامپیسین



شکل 7: طیف سنجی مرئی فرابنفش (A): نانوذرات میله‌ای طلا- ریفامپیسین- کوئرستین، (B): نانوذرات کروی طلا- ریفامپیسین- کوئرستین
 
2-3-6 آزمون سنجش میزان سمیت سلولی
جهت کنترل وضعیت سلول‌ها در محیط کشت، میزان بقا و هم‌چنین بررسی وضعیت سلول‌ها بعد از تیمارهای مختلف دارویی  و نانوذرات، از سنجش MTT استفاده شد. آزمایش MTTیک روش رنگ سنجی است که بر اساس احیا شدن و شکسته شدن کریستال‌های زرد رنگ تترازولیوم به وسیله آنزیم سوکسینات دهیدروژناز موجود در میتوکندری فعال سلول‌های زنده و تشکیل کریستال‌های آبی رنگ نامحلول انجام می‌شود. سپس کریستال‌های تشکیل شده در DMSO حل شده و شدت جذب نوری محلول رنگی حاصله توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر و در طول موج 500 تا 600 نانومتر اندازه گیری می‌شود.کاهش تعداد سلول‌های زنده در نمونه آزمایش منجر به افت فعالیت متابولیکی کل آن گردیده و این کاهش مستقیماً با میزان تشکیل کریستال‌های بنفش رنگ مرتبط است که میزان فعالیت میتوکندری و در نتیجه میزان زنده یا مرده بودن سلول‌ها را نشان می‌دهد. به منظور بررسی میزان اثر سایتوتوکسیسیتی نانوذرات در محیط برون تن، پس از کشت رده سلولی ‌MCF-7 و رسیدن به تراکم مناسب سلولی، سلول ها در پلیت 96 خانه ای به ازای هر خانه 103×5 سلول کاشته شد و یک روز پس از کشت سلول‌ها با غلظت‌های مختلفی (1 تا 320 میکروگرم بر میلی‌لیتر) از نانوذرات کروی و میله‌ای، داروی سیس پلاتین به عنوان کنترل مثبت و محیط کشت بدون دارو به عنوان کنترل منفی تیمار شدند. نتایج حاصل از تست MTT پس از 24 و 48  ساعت از تیمار سلول‌ها بررسی شد و درصد viability به دست آمد و مقدار ic50 با استفاده از نرم‌افزار prism محاسبه گردید. این آزمایش سه بار مورد تکرار قرار گرفت. با توجه به شکل 8 در 24 ساعت اول نانوذرات کروی بیشترین کشندگی را نسبت به نانوذرات میله‌ای و حتی سیس پلاتین داشته است تا جایی که در غلظت 20 میکروگرم بر میلی‌لیتر تقریباً 50 درصد کشندگی داشته است. این نتیجه می¬تواند به دلیل سایز کوچکتر نانوذرات نسبت به نانوذرات میله‌ای و نسبت سطح به حجم و واکنش‌پذیری بیشتر این ذرات و نفوذ سلولی بیشتر نانوذرات کروی باشد. هم‌چنین با گذشت 48 ساعت از تیمار سلولی توسط نانوذرات با کمترین غلظت، ابتدا کشندگی سلول‌های سرطانی توسط نانوذرات میله‌ی بیشتر بود اما در غلظت‌های بیشتر کشندگی نانوذرات کروی طلا بیشتر شده تا جایی که در غلظت‌های بالای 40 تقریباً زنده مانی سلول‌ها به زیر 5 درصد رسیده است. به طور کلی هرچه غلظت نانوذرات در محیط سلولی افزایش میابد درصد زنده مانی سلول‌‌ها کاهش یافته است و اثر این نانوذرات حتی بیشتر از داروی سیس پلاتین مشاهده شد. بنابراین به نظر می‌رسد نانوذرات میله‌ای طلا با غلظت کم برای فتوترمال تراپی بهتر است که نتایج سایر محققین نیز تایید‌کننده این موضوع می‌باشد (25-22). هم‌چنین با هدفمند کردن این نانوذرات برای سلول‌های سرطانی خاص به طور مثال با آنتی بادی خاص، می‌توان علاوه بر استفاده در کشندگی سلول‌های سرطانی، از تاثیر این نانوذرات بر سلول‌های سالم جلوگیری کرد. با کنژوگه کردن ترکیبات مختلف بر سطح این نانوذرات هم می‌توان جذب سلولی را افزایش داد و با استفاده از فتوترمال تراپی سلول‌های سرطانی را از بین برد.
 



شکل 8 :بررسی میزان اثر سایتوتوکسیسیتی غلظت‌های متفاوت نانوذرات کروی و میله¬ای طلا در محیط برون تن بر رده‌ سلولی MCF-7(p˂ 0.0001)

 
بحث
فوتوترمال‌تراپی یک روش درمانی با کمترین تهاجم (مسلماً در صورت عدم کنترل بر روی تابش لیزر، احتمال آسیب به سلول‌های نرمال هم وجود دارد، که با تنظیم شدت لیزر، مدت زمان تابش آن و استفاده از نانوذرات مناسب از عوارض جانبی روش کاهش می‌یابد) است که در آن انرژی فوتون‌ها به انرژی گرمایی تبدیل می‌شود تا هایپرترمیا سلولی القاء شود. پلاسمونیک فوتوترمال‌تراپی به همراه نانوذرات فلزی طلا یک روش جدید و کارآمد برای مقابله با سلول‌های سرطانی است. این روش به دو صورت آپپتوز و نکروز و به دلیل ایجاد گرما از رشد سلول‌های سرطانی جلوگیری می‌کند و در نهایت آن‌ها را از بین می‌برد. در عین حال به دلیل خواص پلاسمونیک نانوذرات طلا، این ترکیبات به عنوان عوامل کنتراست برای شناسایی زودهنگام بیماری‌ها نیز کاربرد دارند (6,‌5). استفاده از هایپرترمیا به عنوان روش درمانی اولیه و کمکی، امروزه به خوبی شناخته شده و در زمینه تحقیقات پزشکی در حال رشد است. در روش هایپرترمیا، دمای بافت تومور به°C 43-40 می‌رسد و این بالارفتن دما توسط مایکرویو، تابش، اولتراسوند، میدان مغناطیسی تناوبی، نور مادون قرمز (IR) یا تابش نور مرئی انجام می‌شود. در دمای بالاتر از °C43، دناتوره شدن پروتئین و تخریب غشاء سلولی اتفاق می‌‌افتد. در عین حال، مزایای قابل‌توجهی بر روی کنترل موضعی تومور و نرخ بقاء کلی هم در هایپرترمیا به عنوان درمان اولیه و هم کمکی، دیده می‌شود (26). فتوترمال‌تراپی باعث مرگ سلول‌های سرطانی عمدتاً از طریق نکروز و آپوپتوز می‌شود اما یکی از مهم‌ترین چالش‌های این روش‌، گرمای بیش از حد است. این گرمای بیش از حد می‌تواند ناشی از دوز زیاد نانوذرات یا قرار گرفتن در معرض لیزر باشد که سبب نکروز می‌شود. در حین نکروز غشای پلاسمایی شکسته و اجزای سیتوپلاسمی به بیرون نشت می‌کنند. التهاب ایجاد شده می‌تواند باعث ایجاد متاستاز و رشد سرطان شود. علاوه بر این، گرمای بیش از حد می‌تواند به سلول‌های سالم همسایه نیز صدمه بزند. از طرف دیگر، فتوترمال‌تراپی باعث ایجاد آپوپتوز از طریق مرگ سلولی برنامه‌ریزی شده می‌گردد که باعث بروز التهاب نمی‌شود. بنابراین، هدف تحقیقات تدوین یک استراتژی جدید از آپوپتوز سلول‌های سرطانی و جلوگیری از نکروز می‌‌باشد (27). با این وجود، گرمایش پایین باعث کاهش کارآیی این روش می‌شود و ممکن است برای سلول‌هایی که مقاومت حرارتی نشان می‌دهند، بسیار مؤثر نباشد. بنابراین شناختن بازیکنان اصلی که در مقاومت در برابر گرما کمک می‌کنند مهم است. بر این اساس، می‌توان استراتژی‌های جدیدی ایجاد کرد که از مقاومت در برابر گرما جلوگیری کرده و آپوپتوز را تقویت ‌کند. عوامل زیادی می‌توانند در مقاومت به گرما نقش داشته باشند مانند: مهار سیگنال‌های مرگ سلولی، مهار اندوسیتوز یا افزایش اگزوسیتوز نانوذرات. آپوپتوز ناشی از گرما هم‌چنین می‌تواند توسط یک کلاس از پروتئین‌ها به نام پروتئین‌های شوک حرارتی (HSPs) مهار شود. هنگام اتصال به پروتئین‌های دناتوره شده یا واسطه‌هایی که تا حدی آشکار نشده‌اند، HSPها از تجمع آن‌ها جلوگیری می‌کنند و باعث القا refolding پروتئین می‌شوند. جالب است که، فتوترمال تراپی بیان اکثر HSPها را القا می‌کند. مطالعات متعدد اهمیت HSP را در مقاوم ساختن سلول‌های سرطانی در برابر آپوپتوز ناشی از گرما نشان داده‌اند با این حال، ویژگی این مهار کننده‌ها در پروتئین‌های شوک حرارتی منحصر به فرد آزمایش نشده است (28). این نتایج منجر به ساخت مهارکننده HSP70 Quercetin) ) کنژوگه شده به نانوذرات طلا شد که در مقایسه با AuNPs بدون کنژوگه، ترکیب جدید نشان داد که توانایی برتر برای مقابله با مقاومت در برابر گرما، باعث می‌شود درصد بیشتری از سلول‌ها تحت آپوپتوز قرار بگیرند. بنابراین، AuNPs در انتقال Quercetin به سلول¬های سرطانی و هم‌چنین به عنوان یک عامل محرک فتوترمال تراپی مرتبط با آپوپتوز عمل می‌کنند (21). در این تحقیق نانوذرات طلا میله‌ای (AuNRs) و کروی با استفاده از یک تکنیک جدید سنتز شد. از میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) برای تعیین کیفیت و همگنی نانوذرات استفاده گردید. این نانوذرات به طور یکنواخت سنتز شدند. سپس از آن‌ها تست UV گرفته شد که نانوذرات میله‌ای دو پیک که پیک کوچک در محدوده 523 نانومتر و پیک بزرگ در محدوده 738 نانومتر مشاهده گردید  که نشان دهنده سنتز صحیح و بدون ناخالصی و با سایز و AR حدود 4 می‌باشد.در مورد نانوذرات کروی هم در طول موج 535 نانومتر پیک مشخصی نشان داد. نتایج به دست آمده در این آنالیز مشابه نتایج سایر محقیقین می‌باشد به عنوان نمونه مشابه تحقیقات Sayed و همکاران در سال 2010 و هم‌چنین Amini و همکاران در سال 2018 می‌باشد. سپس کنژوگه نانوذره‌سرم آلبومین گاوی (BSA) تهیه شد؛ استفاده از BSA به منظور جلوگیری از واکنش‌های ناخواسته انجام گرفت. سپس به ترکیب NPs-BSA، آرژینیل گلیسیلاسپارتیک اسید (RGD) اضافه شد. این ترکیب سبب می‌شود، اندوسایتوز به‌واسطه اینتگرین فعال شود. داروی ریفامپیسین (RF) هم به عنوان مهارکننده اگزوسایتوز اضافه گردید. برای تأیید کنژوگه با RF ، طیف جذب نانوذرات قبل و بعد از کنژوگه با RF بررسی شد. ریفامپیسین به تنهایی در دو طول موج جذب دارد: 330 نانومتر و 470 نانومتر. وقتی که نانوذرات با RF کنژوگه می‌شوند دو پیک جدید در همان طیف uv نانوذرات ظاهر می‌شوند که نشان‌دهنده سنتز صحیح کنژوگه نانوذرات و ریفامپیسین است. اگر HSP70 برای مقاومت سرطان در برابر فتوترمال تراپی ضروری است، پس استفاده از نانوذرات کنژوگه با مهار کننده‌های HSP70 می‌توانند اثرفتوترمال تراپی را بیشتر کند. از آنجا که کوئرستین (QE) یک مهار‌کننده امیدوارکننده HSP70 است، در این تحقیق نانوذرات با QE کنژوگه شدند. برای اطمینان از کنژوگه شدن، میزان جذب نانوذرات با و بدون QE اندازهگیری شد. لازم به ذکر است که QE به تنهایی در طول موج 370 نانومتر جذب دارد.  نانوذرات طلا به تنهایی قبل از کنژوگه شدن باQE ، پیکی در 370 نانومتر را نشان نمی‌‌دهند، با این حال پس از کنژوگه شدن با QE نمایش یک پیک در 370 نانومتر را نشان می‌دهد که ترکیب QE را با نانوذرات تأیید می‌کند. این نتایج با نتایج تحقیقات Moustafa R.K و همکاران در سال 2016 مطابقت دارد (21). سپس اثربخشی نانوذرات طلا کنژوگه شده را بر زنده ماندن سلول‌های سرطانی MCF-7 مورد آزمایش قرار گرفت که کاهش میزان زنده ماندن سلول در مقایسه با گروه شاهد مشاهده شد. در 24 ساعت اول نانوذرات کروی بیشترین کشندگی را نسبت به نانوذرات میله‌ای و حتی سیس پلاتین داشته است تا جایی که در غلظت 20 میکروگرم بر میلی‌لیتر تقریباً 50 درصد کشندگی داشته است. این نتیجه می¬تواند به دلیل سایز کوچکتر نانوذرات نسبت به نانوذرات میله‌ای و نسبت سطح به حجم و واکنش‌پذیری بیشتر این ذرات و نفوذ سلولی بیشتر نانوذرات کروی باشد. هم‌چنین با گذشت 48 ساعت از تیمار سلولی توسط نانوذرات با کمترین غلظت، ابتدا کشندگی سلول‌های سرطانی توسط نانوذرات میله‌ای بیشتر بود اما در غلظت‌های بیشتر کشندگی نانوذرات کروی طلا بیشتر شده تا جایی که در غلظت‌های بالای 40 تقریباً زنده‌مانی سلول‌ها به زیر 5 درصد رسیده است. به طور کلی هرچه غلظت نانوذرات در محیط سلولی افزایش میابد درصد زنده مانی سلول‌ها کاهش یافته است و اثر این نانوذرات حتی بیشتر از داروی سیس پلاتین مشاهده شد. بنابراین به نظر می‌‌رسد نانوذرات میله‌ای طلا با غلظت کم برای فتوترمال تراپی بهتر است که نتایج سایر محققین نیز تاییدکننده این موضوع می¬باشد (25-22). هم‌چنین با هدفمند کردن این نانوذرات برای سلول‌های سرطانی خاص به طور مثال با آنتی بادی خاص، می‌توان علاوه بر استفاده در کشندگی سلول‌های سرطانی، از تاثیر این نانوذرات بر سلول‌های سالم جلوگیری کرد. با کنژوگه کردن ترکیبات مختلف بر سطح این نانوذرات هم می‌توان جذب سلولی را افزایش داد و با استفاده از فتوترمال تراپی سلول‌های سرطانی را از بین برد.
نتیجه‌گیری
در دهه گذشته، بسیاری از نشریات مرتبط با استفاده از نانوذرات طلا (AuNPs) در فتوترمال‌تراپی نتایج امیدوار کننده‌ای برای مقابله با سرطان نشان داده‌اند. در واقع AuNPs  ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی مناسبی در مقایسه با سایر نانوذرات را نشان می‌دهند. نانوذرات طلا که در معرض نور مادون قرمز قرار می‌گیرند آن را جذب کرده با سرعت و کارایی بالا آن را به گرما تبدیل می‌کنند بنابراین، هنگامی که AuNPs درون یا در مجاورت سلول‌های سرطانی قرار گیرند با تابش الکترومغناطیسی توسط لیزر باعث به وجود آمدن گرمای کافی برای از بین بردن سلول‌های سرطانی می‌شود.  علاوه بر این، AuNPs مطلوب هستند زیرا این توانایی را دارند که با مولکول‌های مختلفی که می‌توانند عملکرد آن‌ها را تقویت کنند به راحتی کنژوگه شوند. مطالعات تحقیقات مختلفی برای هدف قرار دادن سلول‌های سرطانی، افزایش جذب سلولی نانوذرات با کنژوگاسیون ترکیب خاص در سطح آن‌ها و یا تولیدAuNPs  با اندازه جدید که در تبدیل انرژی نور به گرما با راندمان بالاتری را توسعه داد. فتوترمال تراپی، مرگ سلولی را از طریق آپوپتوز یا نکروز ایجاد می‌کند. دوزهای بالای گرمایش (بیشتر از 50 درجه سانتی‌گراد) باعث نکروز میشود، که منجر به التهاب شده و برای سلول‌های سالم همسایه مضر است. از طرف دیگر، درجه حرارت پایین‌تر (کمتر از50 درجه سانتی‌گراد) عمدتا باعث بروز آپوپتوز می‌شود، زیرا برنامه‌ریزی برای مرگ سلول یک روش برای از بین بردن سلول‌های سرطانی است. هدف اصلی ما این است که فقط در طول فتوترمال‌تراپی شروع به آپوپتوز کنیم. برای انجام آپوپتوز در دماهای پایین‌تر، مکانیسم‌های سلولی مقاومت در برابر حرارت باید کنار گذاشته شوند. در واقعHSP70  با جلوگیری از فعال‌سازی سیتوکروم c/DATP کاسپاز به عنوان مهار‌کننده بالادست آپوپتوز سلول عمل می‌کند. هرچه سطح اولیه HSP70 کمتر باشد، درصد بیشتری از سلول‌ها پس از فتوترمال تراپی تحت آپوپتوز قرار می‌گیرند. ما این نتایج را با استفاده از ترکیبات نانوذرات میله‌ای و کروی طلا با یک مهار‌کننده پروتئین شوک حرارتی که سلول‌ها را به فتوترمال تراپی حساس می‌کند افزایش دادیم و از این طریق، آپوپتوز را به عنوان مرگ سلولهای سرطان غیر التهابی ترویج می‌کنیم. گسترش این نتایج، نشان دهنده قدم بعدی برای از بین بردن سرطان‌ها به‌طور موثر و با حداقل عوارض جانبی است.
سپاس‌گزاری
این تحقیق، حاصل طرح مصوب در دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه می‌باشد. از کلیه کسانی که به نوعی در تهیه این مقاله مشارکت داشته‌اند تقدیر و تشکر به عمل می‌آید.
حامی مالی: دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه
تعارض در منافع: وجود ندارد.
 
References:
 
1-    Ito A, Shinkai M, Honda H, Kobayashi T. Medical Application of Functionalized Magnetic Nanoparticles. J Biosci Bioeng 2005; 100(1): 1-11.
2-    Luksiene Z. Nanoparticles and their potential application as antimicrobials in the food industry.  In: Food Preservation, Nanotechnology in the Agri-Food Industry,  Grumezescu AM , editor. Academic Press; 2017: 567-601.
3-    Wei W, Zhang X, Zhang S, Wei G, Su Z. Biomedical and Bioactive Engineered Nanomaterials for Targeted Tumor Photothermal Therapy: A Review. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2019; 104: 109891.
4-    Norouzi H, Khoshgard K, Akbarzadeh F. In Vitro Outlook of Gold Nanoparticles in Photo-Thermal Therapy: A Literature Review. Lasers in Medical Science 2018; 33(4): 917-26.
5-    Huang X, El-Sayed MA. Plasmonic Photo-Thermal Therapy (PPTT). Alexandria J Medicine 2011; 47(1): 1-9.
6-    Huang X, Jain PK, El-Sayed IH, El-Sayed MA. Plasmonic Photothermal Therapy (PPTT) Using Gold Nanoparticles. Lasers Med Sci 2008; 23(3): 217-28.
7-    Liu Y, Crawford BM, Vo-Dinh T. Gold Nanoparticles-Mediated Photothermal Therapy and Immunotherapy. Immunotherapy 2018; 10(13): 1175-88.
8-    Li J, Gu M. Gold-Nanoparticle-Enhanced Cancer Photothermal Therapy. IEEE J Selected Topics in Quantum Electronics 2009; 16(4): 989-96.
9-    Wan H, Williams RL, Doherty PJ, Williams DF. A Study of The Reproducibility of the MTT Test. J Materials Science: Materials in Medicine 1994; 5: 154-9.
10-    Ciapetti G, Cenni E, Pratelli L, Pizzoferrato A. In Vitro Evaluation of Cell/Biomaterial Interaction by MTT Assay. Biomaterials 1993; 14(5): 359-64.
11-    Haiss W, Thanh NT, Aveyard J, Fernig DG. Determination of Size and Concentration of Gold Nanoparticles From UV− vis Spectra. Anal Chem 2007; 79(11): 4215-21.
12-    Amendola V, Meneghetti M. Size Evaluation of Gold Nanoparticles by UV− vis Spectroscopy. J Physl Chem C 2009;113(11): 4277-85.
13-    Jana NR, Gearheart L, Murphy CJ. Seed‐Mediated Growth Approach for Shape‐Controlled Synthesis of Spheroidal and Rod-Like Gold Nanoparticles Using a Surfactant Template. Advanced Materials 2001; 13(18): 1389-93.
14-    Saber R, Shakoori Z, Sarkar S, Tavoosidana G, Kharrazi S, Gill P. Spectroscopic And Microscopic Analyses of Rod-Shaped Gold Nanoparticles Interacting with Single-Stranded DNA Oligonucleotides. IET nanobiotechnology 2013; 7(2): 42-9.
15-    Al-Sherbini E-SA. UV–visible Light Reshaping of Gold Nanorods. Materials Chemistry and Physics 2010; 121(1-2): 349-53.
16-    Amini A, Kamali M, Amini B, Najafi A. Enhanced Antibacterial Activity of Imipenem Immobilized on Surface of Spherical and Rod Gold Nanoparticles. J Phys D Appl Phys 2018; 52(6): 065401
17-     Arnida, Malugin A, Ghandehari H. Cellular Uptake and Toxicity of Gold Nanoparticles in Prostate Cancer Cells: A Comparative Study of Rods and Spheres. J Appl Toxicol 2010; 30(3): 212-7.
18-    Parial D, Patra HK, Roychoudhury P, Dasgupta AK, Pal R. Gold Nanorod Production by Cyanobacteria—A Green Chemistry Approach. J Appl Phycol 2012; 24: 55-60.
19-    Liu H, Pierre-Pierre N, Huo Q. Dynamic Light Scattering for Gold Nanorod Size Characterization and Study of Nanorod–Protein Interactions. Gold Bull 2012; 45: 187-95.
20-    Williams DB, Carter CB. The Transmission Electron Microscope. In: Transmission Electron Microscopy. Springer, Boston, MA 1996: 3-17.
21-    Ali MR, Ali HR, Rankin CR, El-Sayed MA. Targeting Heat Shock Protein 70 Using Gold Nanorods Enhances Cancer Cell Apoptosis in Low Dose Plasmonic Photothermal Therapy. Biomaterials 2016; 102: 1-8.
22-    Dickerson EB, Dreaden EC, Huang X, El-Sayed IH, Chu H, Pushpanketh S, et al. Gold Nanorod Assisted Near-Infrared Plasmonic Photothermal Therapy (PPTT) of Squamous Cell Carcinoma in Mice. Cancer Lett 2008; 269(1): 57-66.
23-    Jang B, Park JY, Tung CH, Kim IH, Choi Y. Gold Nanorod− Photosensitizer Complex for Near-Infrared Fluorescence Imaging and Photodynamic/Photothermal Therapy in Vivo. ACS Nano 2011; 5(2): 1086-94.
24-    Choi WI, Kim JY, Kang C, Byeon CC, Kim YH, Tae G. Tumor Regression in Vivo by Photothermal Therapy based on Gold-Nanorod-Loaded, Functional Nanocarriers. ACS Nano 2011; 5(3): 1995-2003.
25-    Mackey MA, Ali MR, Austin LA, Near RD, El-Sayed MA. The Most Effective Gold Nanorod Size for Plasmonic Photothermal Therapy: Theory and in Vitro Experiments. J Phys Chem B 2014; 118(5): 1319-26.
26-    Graham EG, Macneill CM, Levi-Polyachenko NH. Review of Metal, Carbon and Polymer Nanoparticles for Infrared Photothermal Therapy. Nano Life 2013; 3(3): 1330002.
27-    Sheng W, He S, Seare WJ, Almutairi A. Review of the Progress Toward Achieving Heat Confinement—the Holy Grail of Photothermal Therapy. J Biomed Opt 2017; 22(8): 080901.
28-    Tang X, Tan L, Shi K, Peng J, Xiao Y, Li W, et al. Gold Nanorods Together with HSP Inhibitor-VER-155008 Micelles for Colon Cancer Mild-Temperature Photothermal Therapy. Acta Pharmaceutica Sinica B 2018; 8(4):  587-601.

 
نوع مطالعه: پژوهشي | موضوع مقاله: سایر
دریافت: 1399/8/24 | پذیرش: 1400/2/12 | انتشار: 1401/3/15

ارسال نظر درباره این مقاله : نام کاربری یا پست الکترونیک شما:
CAPTCHA

ارسال پیام به نویسنده مسئول


بازنشر اطلاعات
Creative Commons License این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است.

کلیه حقوق این وب سایت متعلق به ماهنامه علمی پ‍ژوهشی دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد می باشد.

طراحی و برنامه نویسی : یکتاوب افزار شرق

© 2022 CC BY-NC 4.0 | SSU_Journals

Designed & Developed by : Yektaweb