ماهنامه علمی پ‍ژوهشی

مقدمه
امروزه، سرطان یکی از علل اصلی مرگ و میر در جوامع بشری است. این بیماری بعد از بیماری‌‌های قلبی-عروقی، شایع‌ترین عامل مرگ انسان‌ها در جهان است (۱). بروز سرطان پروستات در بین مردان، رتبه نخست را در میان سایر سرطان‌ها به خود اختصاص داده و سرطان سینه در بین زنان از شیوع بیشتری برخوردار است (۲). غده پروستات بزرگترین غده جنسی ضمیمه در دستگاه تناسلی مردان است. پروستات در تقسیم‌بندی غدد بدن یک غده برون‌ریز محسوب می‌‌شود، چون مواد ترشحی خود را از راه مجاری به بیرون از بدن می‌ریزد. ترشحات غده پروستات که خاصیت قلیایی دارند، از اسپرم در برابر شرایط اسیدی واژن محافظت می‌‌کنند (5-3). ترشحات این غده نسبتاً زیاد است و حدود یک سوم حجم مایع منی را تشکیل می‌دهند (۶). علاوه بر وظیفه حمل اسپرم، تغذیه و نگهداری اسپرم نیز به عهده مواد مغذی موجود در ترشحات پروستات است که در آن موادی نظیر آلبومین، اسید آسکوربیک، فسفاتاز، کلسیم، روی و آنتی‌ژن اختصاصی پروستات وجود دارد (۷). فرد مبتلا به سرطان پروستات ممکن است در ابتدا هیچ علامتی از بیماری نشان ندهد. با¬این‌حال سرطان پروستات گاهی با مشکلاتی در دفع ادرار و یا درد شکم همراه است (9,8). تکرر ادرار، ضعف در جاری شدن ادرار، بی‌اختیاری ادرار، وجود خون در ادرار، خروج منی همراه با درد، وجود درد مداوم در پایین کمر و ناتوانی جنسی از علایم هشدار دهنده و مهم سرطان پروستات محسوب می‌‌شوند (۱1، ۱0). ژن ELAC2 در انسان نقش رمز‌گذاری پروتئین ELAC2 را به عهده دارد. این ژن روی بازوی کوتاه کروموزوم شماره ۱۷ قرار دارد و محصول آن نوعی اندونوکلئاز است که در مراحل بلوغ tRNA میتوکندریایی، نقش بازی می‌کند (۱۲). پروتئین ELAC2 یک فسفو‌دی‌استراز روی، با وزن ۹۲ کیلودالتون است. پروتئین ELAC2 با حذف ۳ نوکلئوتید از پیش‌سازهای مولکول tRNA، یک گروه 3-پریم هیدروکسی را در انتهای tRNA باقی می‌گذارد و یک گروه 5-پریم فسفوریل را در سمت بریده‌‌شده دیگر این مولکول قرار می‌دهد (۱4، ۱3). انجام این واکنش‌ها نیازمند یون‌های روی (Zn) به‌عنوان کوفاکتور است (۳). جهش‌‌های متعدد ژن ELAC2 با سرطان ارثی پروستات نوع ۲ (hereditary prostate cancer 2: HPC2)، مرتبط هستند (۱6،۱5). جهش‌هایی نظیر حذف، تغییر قالب خوانش، جهش بد‌معنی (missense) و غیره ممکن است در این ژن اتفاق بیفتد که همگی از علل موثر در بروز سرطان ارثی پروستات نوع ۲ هستند (19-17) جهش بد‌معنی یا Missense mutation‎، نوعی جهش نقطه‌ای است که در آن، تغییر فقط یک نوکلئوتید سبب تغییر رمز ژنتیکی شده و اسیدآمینه متفاوتی حاصل می‌گردد. دو مورد از مهم‌ترین جهش‌های بدمعنی در ژن کد‌کننده پروتئین ELAC2، شامل Ser217Leu و Ala541Thr می‌شوند (23-20) گروهی از محققان در با بررسی گسترده جهش‌های ناحیه 17p11 (در بر گیرنده ژن ELAC2) کرومزوم انسان و ارتباط آن با سرطان پرداختند. نتیجه آنالیز ژن ELAC2، چندین نوع از تنوع ژنتیکی در این ناحیه را مشخص نمود که دو نوع از این واریانت‌ها شامل تغییر سرین به لوسین در اسید-آمینه شماره ۲۱۷ (Ser217Leu) و تغییر آلانین به ترئونین در اسیدآمینه شماره ۵۴۱ (Ala541Thr) با سرطان پروستات همراه بودند (29-24) با توجه به مطالب مورد اشاره در بالا که موید وجود شواهدی از تاثیر تغییرات ژنتیکی در ژن ELAC2 در بروز سرطان پروستات است، لذا در این تحقیق پلی‌مورفیسم‌های Ser217Leu و Ala541Thr در ژن ELAC2 و ارتباط آن‌ها با سرطان پروستات در بیماران ایرانی مورد بررسی قرار گرفت.
روش بررسی
نمونه‌گیری
تعداد ۶۴ فرد که از نظر بالینی مشکوک به سرطان پروستات تشخیص داده شده بودند و با یکدیگر نسبت فامیلی نزدیک داشتند، مورد بررسی قرار گرفتند. نمونه‌ها شامل ۵ میلی¬لیتر خون از هر یک از افراد مورد مطالعه بود که با رعایت موازین اخلاقی و پس از تکمیل فرم رضایت‌نامه و با درج مشخصات بالینی لازم، نمونه‌گیری انجام شد. نمونه‌¬های خون در لوله¬های حاوی ماده ضد انعقاد EDTA جمع‌آوری شد. این نمونه‌ها تا زمان شروع آزمایشات مولکولی در فریزر ۲۰- درجه سانتی‌‌گراد نگهداری شدند.
استخراج DNA و بررسی کیفیت
استخراج DNA از هر یک از نمونه‌ها با استفاده از کیت تخلیص DNA (سیناکلون، ایران) مطابق روش‌کار کیت، صورت پذیرفت. کیفیت و کمیت DNA خالص شده، با روش-های الکتروفورز روی ژل آگارز و اسپکتروفتومتری انجام شد. مقدار 3 میکرولیتر از هر یک از نمونه‌‌های DNA تخلیص شده روی ژل آگارز یک درصد حاوی اتیدیوم بروماید، الکتروفورز شد و سپس با نور ماورای بنفش دستگاه ثبت تصویر (Gel‌Documentation)، مشاهده و عکس‌‌برداری شد. هم‌چنین، خوانش غلظت DNA با دستگاه اسپکتروفتومتر و در طول موج‌های ۲۸۰ و ۲۶۰ نانومتر انجام شد.
انجام PCR
واکنش PCR برای تکثیر هر یک از نواحی دربرگیرنده جهش‌های احتمالی Ser217Leu و Ala541Thr با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، انجام شد. برای طراحی پرایمرها از نرم‌افزار Gene Runner بهره گرفته شد و پرایمرهای طراحی شده، توسط شرکت متابیون آلمان سنتز شدند. توالی و مشخصات هر یک از پرایمرهای مورد استفاده در این تحقیق در جدول ۱ آورده شده است. واکنش PCR در حجم نهایی ۲۵ میکرولیتر انجام شد. به این صورت که مقدار 2 میکرولیتر از DNA الگو، ۱۰ پیکومول از هر یک از پرایمرهای 217-F و 217-R یا 541-F و 541-R (بر اساس نوع جهش)، 0/2 میلی‌مولار dNTP Mix، ۲ میلی¬مولار MgCl2 و بافر PCR با غلظت نهایی 1X، با آب دیونیزه به حجم نهایی ۲۵ میکرولیتر رسانده شد. واکنش PCR در دستگاه ترموسایکلر شرکت اپندرف (Master Cycler Gradient, Eppendorf, Germany) مطابق برنامه دمایی و زمانی زیر انجام شد. یک مرحله واسرشت کلی اولیه به مدت ۵ دقیقه در دمای ۹۵ درجه سانتی‌گراد و در ادامه ۳۵ چرخه دمایی شامل ۹۴ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱ دقیقه، ۶۳ درجه سانتی‌گراد به مدت ۴۰ ثانیه و ۷۲ درجه سانتی‌گراد به مدت ۴۰ ثانیه انجام شد. سرانجام، یک مرحله تکثیر تکمیلی به مدت ۷ دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد، اجرا شد. مقدار ۵ میکرولیتر از هر یک از محصولات PCR در کنار مارکر ۱۰۰ جفت بازی (سیناکلون، ایران) روی ژل آگارز ۲ درصد الکتروفورز شدند و با دستگاه ثبت تصویر ژل، عکس‌برداری و ذخیره گردیدند.
تعیین توالی و تشخیص جهش‌‌ها
همه نمونه‌ها برای تعیین توالی به شرکت ژن فناوران ایران ارسال گردیدند. توالی¬های به‌دست آمده با نرم¬افزار Chromas مورد بررسی و تحلیل قرار گرفتند. نتایج توالی¬یابی نسل جدید یا NGS (Next Generation Sequencing) مورد ارزیابی قرار گرفت و شجره¬نامه فامیلی برای افراد مبتلا به بیماری ترسیم شد.
تجزیه و تحلیل آماری
به منظور تجزیه وتحلیل آماری داده‌ها، از آزمون‏های مربع کای و 95% فاصله اطمینان آن (95% confidenceinterval) برآورد شد. آنالیزهای آماری با بهره‌گیری از نرم‌افزار آماری v‏ersion 16 SPSS انجام شد.
ملاحظات اخلاقی
این تحقیق توسط دانشگاه آزاد اسلامی واحد تنکابن با کد اخلاق: IR.IAU.TON.REC.1400.023 ثبت شده است.
نتایج
نتایج آنالیز کمی و کیفی استخراج DNA
نتیجه الکتروفورز DNA‌های استخراج شده نشان‌دهنده کیفیت مناسب نمونه‌ها و عدم شکستگی و اسمیر در ژل آگارز بود. هم‌چنین خوانش جذب نوری مربوط به هر یک از نمونه‌ها با دستگاه اسپکتروفتومتر حاکی از غلظت مناسب و عدم وجود آلودگی مشهود نسبت به پروتئین و پلی‌‌ساکارید و غیره بود. به‌طوری‌که نسبت جذب نوری در طول موج ۲۶۰ به ۲۸۰ نشان‌دهنده عدد نزدیک به 8/1 بود که کیفیت مناسب DNA را نشان می‌دهد.
نتایج واکنش PCR
انجام PCR برای تکثیر ناحیه مربوط به Ser217Leu با استفاده از پرایمرهای اختصاصی این ناحیه (217-F و 217-R) انجام شد و محصول PCR به طول ۲۶۲ جفت‌باز به‌دست آمد. هم‌چنین نتیجه انجام واکنش تکثیری PCR با پرایمرهای 541-F و 541-R برای ناحیه Ala541Thr، باند ۲۴۸ جفت‌بازی را نشان داد. باندهای حاصل از PCR برای هر یک از پلی‌مورفیسم‌های Ser217Leu و Ala541Thr، در شکل ۱ روی ژل آگارز نمایش داده شده است.
نتایج آنالیز تعیین توالی
تعیین¬توالی همه نمونه‌ها انجام شد و با نرم‌افزار Chromas مورد ارزیابی قرار گرفت. برای جهش Ser217Leu، تعداد ۱۲ نمونه جهش‌یافته در هر دو آلل و به¬صورت هموزیگوت (Leu/Leu) (P‌≤‌0/045)، تعداد ۲۶ نمونه هتروزیگوت (Leu/Ser) (P‌≤‌0/037) و تعداد ۲۶ نمونه دیگر حالت نرمال بدون جهش و به‌صورت هموزیگوت (Ser/Ser) (P‌≤‌0/023)بودند. نتایج آنالیز آماری نشان‌دهنده ارتباط معنی‌دار آلل Leu541 با سرطان پروستات بود(P‌≤‌0/033)  (شکل۲). در خصوص جهش Ala541Thr بر پایه داده‌‌های حاصل از تحقیقات پژوهشگران قبلی، مشخص گردیده که نمونه‌های دارای اسیدآمینه آلانین در هر دو نسخه، به صورت هموزیگوت نرمال و نمونه‌های واجد اسیدآمینه‌های آلانین و ترئونین به عنوان هتروزیگوت و نمونه¬های هموزیگوت جهش‌ یافته نیز دارای ترئونین در هر دو نسخه می باشند. در این تحقیق از بین ۶۴ فرد مورد مطالعه، ۵۲ نفر دارای ژنوتیپ نرمال (Ala/Ala) بوده و فقط ۱۲ نفر ژنوتیپ هتروزیگوت (Ala/Thr) را نشان دادند(P‌≤‌0/048) . هیچ یک از نمونه‌ها نیز هموزیگوت جهش‌یافته (Thr/Thr) را در خود نشان ندادند. نتایج آنالیز آماری نشان‌دهنده ارتباط معنی¬دار آلل Thr541 با سرطان پروستات بود (P‌≤‌0/035) (شکل ۳). نتایج حاصل از NGS در جدول ۲ برای هر کدام از جهش‌های یاد شده آورده شده است. شجره‌نامه مربوط به هر یک از جهش¬های Ser217Leu و Ala541Thr به ترتیب در شکل‌های ۴ و ۵ نشان داده شده است. علایم راهنمای این شجره‌نامه‌ها عبارتند از خطوط افقی که نشان‌دهنده ازدواج، خطوط عمودی نشان‌دهنده فرزندان، دایره نشان‌دهنده فرد مونث، مربع نشان‌دهنده فرد مذکر و دایره و مربع تیره نشان‌دهنده فرد با ناهنجاری می‌باشد.
 
جدول 1: پرایمرهای مورد استفاده در این پژوهش


جدول 2: توالی¬یابی نسل جدید انجام شده برای جهش¬های Ser217Leu و Ala541Thr



شکل ۱: تصویر نتیجه الکتروفورز محصولات PCR مربوط به هر یک از پلی‌مورفیسم‌های Ser217Leu و Ala541Thr روی ژل آگارز ۲ درصد. ستون 1، نتیجه انجام PCR برای پلی¬مورفیسم Ala541Thr را نشان می‌‌دهد که باند 248 جفت‌بازی روی ژل دیده می‌شود. ستون‌های 2 و 3، نشان‌دهنده باند 262 جفت‌بازی مربوط به جهش Ser217Leu است. ستون 4، کنترل منفی (بدون DNA الگو) و ستون 5، مارکر 100 جفت‌بازی است.

‌

شکل ۲: تصویر حاصل از تعیین توالی ناحیه Ser217Leu که جهش هتروزیگوت در محل فلش دیده می‌شود.


شکل 3: تصویر حاصل از تعیین توالی ناحیه Ala541Thr که جهش هتروزیگوت در محل فلش دیده می‌‌‌شود.



شکل ۴: نمودار شجره‌نامه خانواده مورد بررسی برای حضور جهش Ser217Leu.


شکل ۵: نمودار شجره‌نامه خانواده مورد بررسی برای حضور جهش Ala541Thr
 
بحث
سرطان پروستات یکی از شایع‌ترین سرطان‌ها در بین مردان در سراسر جهان است (۲۹). علاوه ‌بر‌این، دومین علت مرگ و میر ناشی از سرطان بعد از سرطان ریه است. میزان بروز سرطان پروستات در نقاط مختلف جهان، متفاوت است. بالاترین میزان بروز این بیماری در آمریکای شمالی مشاهده شده و کمترین میزان بروز آن در جنوب شرقی آسیا است (29-27). مهم‌‌ترین عوامل خطرساز شناخته شده برای سرطان پروستات عبارتند از سن، وراثت و منشاء قومی. شیوع آن بعد از دهه شصت زندگی به‌طور چشم‌گیر افزایش می‌یابد. درصورت وقوع این بیماری در افراد جوان، خطر مرگ برای اینگونه افراد افزایش می‌‌‌یابد. هم‌چنین بررسی‌‌ها نشان می‌دهد، مردانی که در خانواده‌هایی با فرم ارثی از سرطان پستان با جهش BRCA2 هستند، خطر ابتلا به سرطان پروستات در آن‌ها بیشتر است (14، 5). پروتئین ELAC2 یک آنزیم فسفو‌دی‌استراز روی است که در انسان توسط ژن ELAC2 کد-گذاری می‌شود. این ژن بر روی کروموزوم ۱۷ قرار دارد و تصور می‌شود محصول این ژن یک اندونوکلئاز است که در بلوغ tRNA میتوکندریایی دخیل است (۳۰). از لحاظ بالینی، چند شکلی‌های ژن ELAC2 با سرطان پروستات ارثی ۲ (HPC2) که یک بیماری مرتبط با سرطان خانوادگی پروستات است، همراه است. تاکنون جهش‌های متعددی در این ژن از جمله جهش‌های حذفی و میس‌سنس به‌عنوان عامل این بیماری از خانواده‌های مختلف گزارش شده است. علاوه‌براین، جهش در ژن ELAC2، موجب کاهش فسفوریلاسیون اکسیداتیو ۱۷ (COXPD17) می‌شود که یک اختلال نادر اتوزومی مغلوب مربوط به عملکرد میتوکندری همراه با کاردیومیوپاتی هایپرتروفی شدید است. از موارد جهش میس سنس مهم که در ژن ELAC2 رخ می‌دهد می‌توان به تبدیل سرین به لوسین و هم‌چنین تبدیل آلانین به ترئونین که در مطالعه حاضر به بررسی آن‌ها پرداخته شد، اشاره کرد (1،16،31). در این تحقیق از افراد مشکوک به سرطان پروستات، نمونه خون تهیه شد. پس از استخراج DNA، واکنش PCR برای هر یک از جهش¬های Ser217Leu و Ala541Thr با پرایمرهای اختصاصی انجام شد. نتایج تعیین‌توالی محصولات PCR، نشان داد که برای جهش Ser217Leu، 75/18 درصد از افراد مورد مطالعه ژنوتیپ هموزیگوت Leu/Leu، 6/40 درصد ژنوتیپ هتروزیگوت Leu/Ser و بقیه افراد حالت نرمال بدون جهش به صورت هموزیگوت Ser/Ser را دارا بودند. هم‌چنین، نتایج مطالعه ما در مورد جهش Ala541Thr، نشان داد که 75/18 درصد افراد دارای ژنوتیپ هتروزیگوت Ala/Thr و 81/25 درصد نیز واجد ژنوتیپ نرمال Ala/Ala بودند. بدین‌ترتیب هیچ یک از افراد مورد مطالعه هموزیگوت جهش‌یافته Thr/Thr را در خود نشان ندادند. در سال ۲۰۰۰،Rebbeck  و همکارانش به یافته‌هایی دست یافتند که در یک جمعیت مستقل ایالات‌متحده از ۳۵۹ پرونده سرطان پروستات که برای سابقه خانوادگی انتخاب نشده بودند، ۲۶۶ مورد دارای آلل Thr541  با افزایش ۲ تا ۴ برابری خطر سرطان پروستات همراه بودند. ژنوتیپ Ser217Leu در بین موارد و کنترل‌ها تفاوت نداشت. مطالعات بعدی از ایالات‌متحده در میان موارد HPC و SPC و خانواده¬های دچار سرطان پروستات که با غربالگری مشخص شدند، نشان دادند که افزایش خطر سرطان پروستات به نوع Ala541Thr یا نوع Ser217Leu، و یا ترکیبی از آن‌ها بستگی دارد (۲۰). نتایج حاصل از تحقیق ما با نتایج بررسی‌های‌Rebbeck  و همکاران مشابه بود و هر دو نشان‌دهنده ارتباط جهش‌های مورد نظر با سرطان پروستات بود. Fujiwara و همکاران در سال ۲۰۰۲ واریانت‌های Ala541Thr و  Ser217Leuرا در ژاپن مورد مطالعه قرار دادند. آن‌ها جهش‌های مذکور را در ۳۵۰ بیمار مبتلا به سرطان پروستات، ۱۱۴ فرد مشکوک و در معرض خطر ابتلا و ۲۴۲ مرد سالم بررسی کردند. هر دو آلل Leu217 و Thr541 در بیماران بیشتر از گروه کنترل بودند و نسبت احتمالی همراه با این واریانت‌ها در ژاپن بالاتر از نقاط دیگر دنیا بود و به‌طور قابل‌توجهی افزایش خطر ابتلا به سرطان پروستات را در ژاپن به وجود می¬آورد (۱۱). Xu و همکاران در سال ۲۰۱۰ به بررسی ارتباط چندشکلی‌¬های ژن ELAC2 و خطر ابتلا به سرطان پروستات پرداختند. این محققان در نهایت نشان دادند که آلل Leu217 در مقایسه با آلل Ser217، به¬صورت معنی‌داری (0/019=p) خطر ابتلا به سرطان پروستات را بالا می‌‌برد. در تحقیق ما نیز این موضوع به وضوح دیده می‌شود. همین محققین نشان دادند که آلل Thr541 در مقایسه با آلل Ala541 نیز به‌صورت معنی‌داری (0/131=p) خطر بروز سرطان پروستات را افزایش می‌‌دهد (۸). همانطور که در نمونه پژوهش‌‌های قبلی ذکر شده در بالا ملاحظه می¬شود، مشخص گردیده که نمونه‌های دارای اسیدآمینه ترئونین یا لوسین نشان‌دهنده استعداد ابتلا به سرطان پروستات است. از آنجا که این تحقیق روی افراد مشکوک به ابتلا به سرطان پروستات انجام شده است، به طور کلی نتایج نشان‌دهنده فراوانی بیشتر آلل‌های Thr541 و Leu217 به ترتیب نسبت به آلل‌های Ala541 و Ser217، در افراد مشکوک به سرطان پروستات بود. لذا بررسی چندشکلی جهش‌‌های Ser217Leu  و Ala541Thr در ژن‌ ELAC2 ‌می¬تواند به¬عنوان شاخص مناسبی جهت بررسی استعداد ابتلا به سرطان پروستات در کشور ما مد نظر قرار گیرد.
نتیجه‌گیری
چندشکلیهای Ser217Leu و Ala541Thr در ژن ELAC2 را می‌توان همراه با سایر سنجش‌ها به‌عنوان مارکر‌های پیش آگهی‌دهنده در شناسایی زود هنگام سرطان پروستات به کار گرفت.
سپاس‌گزاری
بدین‌وسیله مراتب تقدیر و تشکر خود را از پژوهشگران شرکت سینا برنا آریا آقایان محمد چهل‌گردی، صابر کبیری و حمیدرضا کبیری به عمل می‌آورند و هم‌چنین این مقاله حاصل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد می‌باشد.
حامی مالی:. ندارد.
تعارض در منافع: وجود ندارد.

 
References:
 
1-    AlHarthi FS, Qari A, Edress A, Abedalthagafi M. Familial/Inherited Cancer Syndrome: A Focus on the Highly Consanguineous Arab Population. NPJ Genomic Med 2020; 5(1): 3.
2-    Beuten J, Gelfond JAL, Franke JL, Shook S, Johnson-Pais TL, Thompson IM, Leach RJ. Single and Multivariate Associations of MSR1, ELAC2, And RNASEL with Prostate Cancer in an Ethnic Diverse Cohort of Men. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2010;19(2): 588-99.
3-    Brzezniak LK, Bijata M, Szczesny RJ, Stepien PP. Involvement of Human ELAC2 Gene Product in 3′ End Processing of Mitochondrial Trnas. RNA Biol 2011; 8(4): 616-26.
4-    Burden HP, Holmes CH, Persad R, Whittington K. Prostasomes - Their Effects on Human Male Reproduction and Fertility. Hum Reprod Update 2006; 12(3): 283-92.
5-    Castro E, Eeles R. The Role of BRCA1 and BRCA2 in Prostate Cancer. Asian J Androl 2012; 14(3): 409-14.
6-    Dong JT. Prevalent Mutations in Prostate Cancer. J Cell Biochem 2006; 97(3): 433-47.
7-    Doosti A, Dehkordi PG. The P53 Codon 72 Polymorphism and Association to Prostate Cancer in Iranian Patients. African J Biotechnol 2011; 10(60): 12821-825.
8-    Dupont WD, Breyer JP, Johnson SH, Plummer WD, Smith JR. Prostate Cancer Risk Variants of the HOXB Genetic Locus. Sci Rep 2021; 11(1): 11385.
9-    Fay EK, Graff JN. Immunotherapy in Prostate Cancer. Cancers (Basel) 2020; 12(7): 1752.
10-    Fitzmaurice C, Allen C, Barber RM, Barregard L, Bhutta ZA, Brenner H, et al. Global, Regional, and National Cancer Incidence, Mortality, Years of Life Lost, Years Lived with Disability, And Disability-Adjusted Life-Years for 32 Cancer Groups, 1990 To 2015: A Systematic Analysis for the Global Burden of Disease Study Global Burden. JAMA Oncol 2017; 3(4): 524-48.
11-    Fujiwara H, Emi M, Nagai H, Nishimura T, Konishi N, Kubota Y, et al. Association of Common Missense Changes in ELAC2 (HPC2) with Prostate Cancer in a Japanese Case - Control Series. J Hum Genet 2002; 47(12): 641-48.
12-    Del Giudice F, Kasman AM, Ferro M, Sciarra A, De Berardinis E, Belladelli F, et al. Clinical Correlation among Male Infertility and Overall Male Health: A Systematic Review of the Literature. Investig Clin Urol 2020; 61(4): 355-71.
13-    Husby A, Wohlfahrt J, Melbye M. Vasectomy and Prostate Cancer Risk: A 38-Year Nationwide Cohort Study. J Natl Cancer Inst 2020; 112(1): 71-7.
14-    Junejo NN, AlKhateeb SS. BRCA2 Gene Mutation and Prostate Cancer Risk. Saudi Med J 2020; 41(1): 9-17.
15-    Kamran SC, D’Amico AV. Radiation Therapy for Prostate Cancer. Hematol Oncol Clin North Am 2020; 34(1): 45-69.
16-    Merriel SWD, Funston G, Hamilton W. Prostate Cancer in Primary Care. Adv Ther 2018; 35(9): 1285-94.
17-    Merriel SWD, Ingle SM, May MT, Martin RM. Retrospective Cohort Study Evaluating Clinical, Biochemical and Pharmacological Prognostic Factors for Prostate Cancer Progression Using Primary Care Data. BMJ Open 2021; 11(2): e044420.
18-    Ni Raghallaigh H, Eeles R. Genetic Predisposition to Prostate Cancer: An Update. Fam Cancer 2021.
19-    Perdomo-Ramirez A, Antón-Gamero M, Rizzo DS, Trindade A, Ramos-Trujillo E, Claverie-Martin F. Two New Missense Mutations in the Protein Interaction ASH Domain of OCRL1 Identified in Patients with Lowe Syndrome. Intractable Rare Dis Res 2020; 9(4): 222-8.
20-    Rebbeck TR, Walker AH, Zeigler-Johnson C, Weisburg S, Martin AM, Nathanson KL, et al. Association of HPC2/ELAC2 Genotypes and Prostate Cancer. Am J Hum Genet 2000; 67(4): 1014-19.
21-    Rodrigues CHM, Pires DEV, Ascher DB. Dynamut2: Assessing Changes in Stability and Flexibility Upon Single and Multiple Point Missense Mutations. Protein Sci 2021; 30(1): 60-9.
22-    Röhnisch HE, Kyrø C, Olsen A, Thysell E, Hallmans G, Moazzami AA. Identification of Metabolites Associated with Prostate Cancer Risk: A Nested Case-Control Study with Long Follow-Up in the Northern Sweden Health and Disease Study. BMC Med 2020; 18(1): 187.
23-    Severi G, Giles GG, Southey MC, Tesoriero A, Tilley W, Neufing H, et al. ELAC2/HPC2 Polymorphisms, Prostate-Specific Antigen Levels, And Prostate Cancer. J Natl Cancer Inst 2003; 95(11): 818-24.
24-    Shill DK, Roobol MJ, Ehdaie B, Vickers AJ, Carlsson SV. Active Surveillance for Prostate Cancer. Transl Androl Urol 2021; 10(6): 2809-19.
25-    Smolders S, Philtjens S, Crosiers D, Sieben A, Hens E, Heeman B, et al. Contribution of Rare Homozygous and Compound Heterozygous VPS13C Missense Mutations to Dementia with Lewy Bodies and Parkinson’s Disease. Acta Neuropathol Commun 2021; 9(1): 25.
26-    Taitt HE. Global Trends and Prostate Cancer: A Review Of Incidence, Detection, And Mortality as Influenced by Race, Ethnicity, And Geographic Location. Am J Mens Health 2018; 12(6): 1807-23.
27-    Tavtigian SV, Simard J, Teng DHF, Abtin V, Baumgard M, Beck A, et al. A Candidate Prostate Cancer Susceptibility Gene at Chromosome 17p. Nat Genet 2001; 27(2): 172-80.
28-    Verze P, Cai T, Lorenzetti S. The Role of the Prostate in Male Fertility, Health and Disease. Nat. Rev Urol 2016; 13(7): 379-86.
29-    Xu B, Tong N, Li JM, Zhang ZD, Wu HF. ELAC2 Polymorphisms and Prostate Cancer Risk: A Meta-Analysis Based on 18 Case-Control Studies. Prostate Cancer Prostatic Dis 2010; 13(3): 270-77.
30-    Zhao W, Yu H, Li S, Huang Y. Identification and Analysis of Candidate Fungal Trna 3′-End Processing Endonucleases Trnase Zs, Homologs of the Putative Prostate Cancer Susceptibility Protein ELAC2. BMC Evol Biol 2010; 10(1): 272.
31-    Zhu Y, Wei Y, Pan J, Fang B, Ye D. Prostate Cancer with Homologous Recombination Repair Gene Mutations and PARP Inhibitors: Clinical Progress. Chinese J Urol 2021; 42(5): 397-400.