ماهنامه علمی پ‍ژوهشی

مقدمه
پیری، مجموعه ای از تغییرات فیزیولوژیک مختلف، باعث کاهش کارکرد زیست شناختی در انسان می شود (1). این فرآیند، عملکرد فیزیولوژیک بدن را با ضعف، کاهش توانایی، افزایش ریسک بروز بیماری های مهمی از جمله سرطان، دیابت، اختلالات قلبی عروقی و بیماری های تحلیل برنده سیستم عصبی مواجه کرده و نهایتاً منجر به افزایش احتمال مرگ می‌گردد (2). یافتن راهکارهایی که فرآیند پیری را به تعویق بیاندازد بسیار حائز اهمیت است و محققان زیادی روی آن تمرکز کرده‌اند. مطالعات، حاکی از آن است که تغییرات ژنتیکی، رژیم غذایی و برخی داروها می توانند روند پیری را به تاخیر بیاندازند. با توجه به این که جمعیت سالخورده سالانه افزایش چشمگیری دارد و عامل خطری برای بیماری¬های مزمن و مرگ و میر است، انجام تحقیقات پیرامون بهبود سلامت انسان و فرآیند پیری امری مهم شمرده می شود (3). طبق آمار پیش‌بینی شده توسط سازمان جهانی بهداشت تعداد افراد سالمند بالای 60 سال موجود در سال 2025 به 2/1 میلیارد نفر می رسد که 70% آن در کشورهای در حال توسعه زندگی می کنند (4). در ایران نیز این جمعیت بالای 60 سال تا سال 2020 حدود 10 میلیون نفر و به‌نظر می¬رسد تا سال 2050 به بیش از 26 میلیون نفر خواهد رسید (5). از جمله مسائل حائز اهمیتی که فرد سالمند با آن روبه رو می شود افسردگی است. افسردگی را می‌توان به‌عنوان شایع‌ترین و مهم‌ترین عامل آسیب به عملکرد روانی- اجتماعی فرد سالمند قلمداد کرد، که متأسفانه هنوز به درستی تشخیص داده نمی شود و درمان صحیح نیز برای آن صورت نمی گیرد (6). افسردگی، کیفیت زندگی سالمندان را کاسته و وابستگی آن¬ها را به دیگران افزایش می دهد (7).
هم‌چنین طول درمان افسردگی در سالمندان به بازه زمانی بیشتر نیازمند است و هزینه بالاتری را نیز به دنبال خواهد داشت (8). اختلالات اضطرابی از شایع¬ترین اختلالات روانپزشکی¬اند که در سنین پیری تجربه می شوند. این اختلالات از شیوع بالاتری نسبت به افسردگی در افراد سالمند مشاهده می شود (10, 9). از جمله مهم¬ترین اضطراب¬های دوران کهولت در ارتباط با بیماری های ناشی از پیری می باشد (11). هم چنین در طی روند زندگی با افزایش سن، اختلال حافظه رخ خواهد داد (12). بروز این اختلال با درجات مختلفی نمایان شده (13)، که باعث نقص در اطلاعات دسته بندی شده ذهن به ویژه حافظه اپیزودیک می گردد (14). متفورمین، از دسته بیگوانیدها، به صورت گسترده به‌عنوان خط اول درمانی دیابت نوع دو مورد استفاده قرار می¬گیرد (16, 15). مطالعات نشان داده¬اند که متفورمین با عبور از سد خونی مغزی قادر به ایجاد اثرات محافظت کننده نورونی و ضد التهابی می¬باشد (17). مکانیسم‌های متعددی برای اثرات مطلوب مغزی متفورمین ذکر شده است. مورد قبول¬ترین آن‌ها تحریک پروتئین کیناز فعال شده با آدنوزین مونو فسفات (AMP-activated protein kinase/AMPK) است. AMPK به‌‌طور مستقیم با افزایش نسبت AMP به ATP در شرایط استرس متابولیک از جمله هیپوکسی و محرومیت از گلوکز فعال می‌شود (18). داروی متفورمین از طریق افزایش AMKP می تواند باعث افزایش سطح فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز (Brain derived neurotrophic factor/BDNF)، بهبود وضعیت نورونی و حافظه شود (19). نشان داده شده است که متفورمین می تواند از التهاب سلولی و فعال شدن واسطه¬های استرس اکسیداتیو که منجر به آپوپتوز و مرگ سلولی می‌شوند، جلوگیری کند (20). نقایص شناختی و حافظه ای و به‌خصوص افسردگی و اضطراب از جمله مشکلات عمده و ناتوان¬کننده در دوران پیری می‌باشند و تاکنون راهکار درمانی موفقی برای رفع این عوارض پیدا نشده است. با توجه خواص متعدد فارماکولوژیک مفید داروی متفورمین (مانند اثرات تنظیم‌کننده قند خون، آنتی‌اکسیدانی، ضد التهاب و ضد پیری)، با استفاده از مدل حیوانی به بررسی عملکرد این دارو بر نقص حافظه، اضطراب و افسردگی در موش¬های صحرایی پیر پرداخته شد. نتایج این مطالعه می‌تواند روشنگر اثرات احتمالی مفید این دارو و هم چنین تعیین دوز دقیق موثر آن سودمند باید.
روش بررسی
حیوانات
در این مطالعه تجربی از 24 سر موش¬های صحرایی نر نژاد ویستار 22 ماهه که وزن 300-280 گرم داشتند، استفاده گردید (21). حیوانات از مرکز نگهداری حیوانات دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان تهیه و نگهداری شدند. دسترسی آزادانه به آب و غذا رعایت شد. هم‌چنین دمای محیطی استاندارد (23 درجه سانتی گراد)، حداقل استرس و 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی استاندارد (7 صبح تا 7 شب) برقرار بود. مراحل کار و مراقبت از حیوانات بر اساس دستورالعمل دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان انجام گرفت.
دارو
در این مطالعه به دو گروه تیمار داروی متفورمین با دوزهای 1 و 10 میلی گرم بر کیلوگرم به صورت خوراکی (گاواژ) به مدت 40 روز (یک بار در روز) به حیوانات مورد مطالعه داده شد (22). گروه کنترل نیز به منظور یکسان سازی آب به صورت خوراکی دریافت کرد.
گروه بندی حیوانات
تحقیق حاضر از سه گروه تشکیل شده که به شرح زیر می‌باشد (تعداد 8 سر موش صحرایی در هر گروه آزمایش قرار داشت) با توجه به مطالعات قبلی نحوه نمونه‌گیری و جمعیت مورد مطالعه انتخاب شد (23, 22):
1-گروه اول: گروه کنترل: شامل موش هایی که فقط پیری طبیعی دارند و آب را (یک میلی لیتر) به صورت خوراکی دریافت کردند.
2- گروه دوم: شامل موش هایی که همراه با پیری طبیعی، متفورمین با دوز 1 میلی گرم بر کیلوگرم را دریافت کردند.
3-گروه سوم: شامل حیوانات پیر طبیعی است که دوز 10 میلی گرم بر کیلوگرم متفورمین را دریافت کردند.
بررسی حافظه کاری با استفاده از آزمون ماز Y شکل
جهت بررسی حافظه کاری از یک آزمون رفتاری به نام آزمون ماز Y شکل (Y-maze spontaneous alternation test) استفاده گردید. عملکرد حافظه کاری حیوانات در این آزمون، از طریق مشاهده و اندازه گیری رفتار تناوب خودبه‌خودی حیوان در یک جلسه کاری به مدت 8 دقیقه بررسی شد . ماز مربوطه از جنس پلکسی گلاس مشکی رنگ است و دارای 3 بازو به ابعاد40 × 30 × 15 سانتی متر بوده که از طریق یک محوطه مرکزی به هم متصل هستند. جهت اجرای این آزمون، موش صحرایی را در قسمت انتهایی یک بازو قرار دادیم و امکان دسترسی آزاد به تمام نواحی ماز وجود داشت. تعداد دفعات ورود حیوان بداخل هر بازو با مشاهده نمودن ثبت شد. ورود حیوان بداخل یک بازو زمانی است که پاهای عقبی حیوان به‌طور کامل در داخل بازو قرار بگیرند. رفتار تناوب به عنوان ورودهای موفق و پشت سر هم به داخل تمام بازوها در مجموعه های سه تایی در نظر گرفته ¬شد. بدین ترتیب درصد تناوب از نسبت تناوب مشاهده شده به حداکثر تناوب (2- تعداد کل بازوهای وارد شده )  ×100 محاسبه گردید. بعد از انجام هر تست برای هر موش، ماز Y شکل با الکل 10% تمیز شد (24).
آزمون ماز به‌علاوه‌ای شکل مرتفع ( (Elevated plus-maze/EPM برای بررسی رفتار شبه اضطرابی:
این ابزار از جنس چوب و دارای چهار بازو به شکل علامت مثبت است. دو بازو باز و دو بازو بسته می¬باشد. ابعاد راهرو باز و بسته 10*50 سانتی‌متر بوده و دو طرف و انتهای راهرو بسته، دیواره‌ای به بلندی 40 سانتی‌متر داشته و برای جلوگیری از افتادن موش‌ها در دو طرف و انتهای بازوی باز لبه هایی به ارتفاع 1 سانتی‌متر از جنس شیشه تعبیه شده است. چهار راهرو توسط یک محدوده مرزی به ابعاد 10 ×10 سانتی‌متر به یکدیگر اتصال دارند. ماز توسط پایه های چوبی در ارتفاع 50 سانتی‌متر از سطح زمین قرار داشت. موش‌ها درون محدوده مرکزی قرار گرفتند، به طوری که صورت موش رو به بازوی باز گذاشته شد. نور مناسب توسط لامپ که در ارتفاع 120 سانتی‌متری از مرکز ماز قرار داشت، تأمین گردید. در مدت 5 دقیقه‌ای که حیوان آزادانه در قسمت‌های مختلف ماز حرکت داشت، موارد زیر به روش مشاهده اندازه‌گیری شد: 1-تعداد دفعاتی که حیوان وارد راهرو باز شد. 2- تعداد دفعاتی که حیوان وارد راهرو بسته شد. 3- مدت زمانی که حیوان در راهرو باز باقی ‌ماند. 4- مدت زمانی که حیوان در راهرو بسته باقی ماند. منظور از ورود به راهرو باز یا بسته هنگامی است که هر چهار پای حیوان وارد راهرو شده باشد. زمان گذرانده شده در هر راهرو نیز بر همین اساس محاسبه شد. برای هر حیوان درصد تعداد ورود به بازوی باز و درصد زمان گذرانده شده در راهرو باز اندازه¬گیری گردید (25).
تست شنای اجباری به منظور ارزیابی افسردگی
آزمون شنای اجباری (forced swim test) یکی از معمول‌ترین مدل¬های حیوانی برای ارزیابی افسردگی است. کاهش فعالیت حیوان در استوانه پر از آب به عنوان معیاری از افسردگی تلقی می¬گردد. به‌منظور اجرای این روش، هر حیوان به‌طور مجزا در استوانه¬ای از جنس پلکسی گلاس با ابعاد 25 سانتی متر قطر، 50 سانتی متر ارتفاع و حاوی آب تا ارتفاع 35 سانتی‌متر با دمای 23 تا 25 درجه سانتی گراد قرار داده شد و به‌وسیله دوربین، رفتار آن ها به‌مدت 6 دقیقه ثبت گردید. زمان بی حرکتی در طول 5 دقیقه آخر سنجیده و به‌عنوان معیاری از رفتار های شبه افسردگی در نظر گرفته شد. بی¬حرکتی به معنای عدم تحرک حیوان به سمت های مختلف در نظر گرفته شد (26).
تجزیه و تحلیل آماری
داده¬ها در نرم‌افزار Graphpad Prism نسخه 6 مورد آنالیز قرار گرفت. تمامی داده¬ها به صورت Mean±SEM نشان داده می شوند. برای مقایسه گروهی از روش آنالیز واریانس و سپس Tukey-post Hoc-test استفاده شد. P<0/05 به‌عنوان سطح معنی‌داری به لحاظ آماری در نظر گرفته شد.
ملاحظات آماری
پروپوزال این تحقیق توسط دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان تایید شده است (کد اخلاق 1397.050.IR.RUMS.REC).
نتایج
1-    نتایج حاصل از آزمون ماز -Yشکل
نتایجی که از این آزمون به دست می آید نشان‌دهنده حافظه کاری کوتاه مدت در موش های آزمایشگاهی است (شکل 1). در مورد گروه متفورمین با دوز 1 میلی گرم بر کیلوگرم تفاوتی با گروه کنترل دیده نشد و بهبودی در حافظه موش ها ملاحظه نگردید. گروه متفورمین با دوز 10 میلی گرم بر کیلوگرم در مقایسه با گروه کنترل توانست در میزان حافظه بهبودی ایجاد نماید هر چند که این افزایش در تعداد حرکات متناوب خودبه‌خوی به لحاظ آماری معنادار نبود (p >0/05).
2-    نتایج حاصل از آزمون ماز به‌علاوه‌ای شکل مرتفع
درصد تعداد ورود به دو بازوی باز (شکل 2) و درصد مدت زمان گذرانده شده در دو بازوی باز (شکل 3) محاسبه شدند. هر چه این دو مورد بیشتر باشند نشانگر اضطراب کمتر موش-ها است. در مقابل هر چه این دو مورد کمتر باشد یعنی موش بیشتر در بازو¬های بسته بماند این مفهوم را می رساند که دچار اضطراب بیشتری است. مشاهدات نشان داد که گروه دریافت‌کننده متفورمین با دوز mg/kg 1، از نظر رفتار شبه اضطرابی تفاوت معناداری با گروه کنترل ندارد (p >0/05). هم‌چنین گروه دریافت کننده متفورمین با دوز mg/kg 10 در هر دو مورد (درصد تعداد و مدت به بازوی باز) توانست تفاوت معنی‌داری را نمایان سازد (P<0/001).
3-    نتایج حاصل از آزمون شنای اجباری:
آزمون شنای اجباری آزمونی است که برای سنجش میزان افسردگی در موش های آزمایشگاهی مورد استفاده قرار گرفت. موش‌های آزمایشگاهی پس از قرار گرفتن در آب حرکات متنوعی برای غرق نشدن اجرا کردند. این حرکات شامل: شنا کردن در عرض ظرف، تقلا کردن (دست و پا زدن) و بی-حرکتی می باشند. زمان بی حرکتی برای موش ها به‌منزله میزان افسردگی می باشد. هر چه این زمان بیشتر باشد نشان دهنده بالاتر بودن سطح افسردگی است. در این آزمون حیوانات در گروه متفورمین با دوز mg/kg 1 در مقایسه با گروه کنترل اختلاف معنی داری ایجاد نکردند. در مقابل، حیوانات در گروه  متفورمین با دوز mg/kg 10 نسبت به گروه کنترل کاهش معنی¬داری (P<0/001) را در میزان افسردگی نشان دادند (شکل 4).
 

شکل1: تاثیر پیری و متفورمین بر میزان درصد رفتار تناوبی در ماز Y شکل
داده¬ها به‌صورت Mean±SEM نشان داده شده اند. متفورمین با دوز 1 میلی گرم بر کیلوگرم در قیاس با گروه کنترل تغییراتی در حافظه را ایجاد نکرد.
گروه متفورمین با دوز 10 میلی گرم بر کیلوگرم توانست تا حدی بهبودی و اثر مثبت در حافظه را در مقایسه با گروه کنترل به‌وجود بیاورد.


شکل2: تاثیر پیری و متفورمین در آزمون ماز بعلاوه ای شکل مرتفع
گروه متفورمین با دوز 1 در مقایسه با گروه کنترل تفاوت معنی داری را نشان نداد. اما گروه متفورمین با دوز 10 در مقایسه با گروه کنترل افزایش معنی‌داری را به‌وجود آورد و سطح اضطراب را کاهش داد. P<0/05* در مقابل گروه کنترل.

شکل3: تاثیر پیری و متفورمین در آزمون بعلاوه ای شکل
داروی متفورمین با دوز 1 نسبت به‌گروه کنترل تغییر قابل قبولی ندارد اما گروه متفورمین با دوز 10 توانست به‌طور چشمگیری افزایش معنی‌دار نسبت به گروه کنترل را ایجاد نماید بدین معنی که اضطراب را به طور قوی کاهش داد. P<0/001 *** در مقابل گروه کنترل.

شکل4: تاثیر متفورمین و پیری بر میزان افسردگی
در قیاس با گروه کنترل، گروه متفورمین با دوز 1 موفق به کاهش افسردگی نشد اما گروه متفورمین با دوز 10 توانست به خوبی سطح افسردگی را کاهش دهد.P<0/001 *** در مقابل گروه کنترل.
بحث
مطالعه حاضر با هدف بررسی اثر متفورمین بر روند پیری انجام گرفت. طی روند پیری عملکرد شناختی، حافظه و هم چنین توانایی جسمانی افت پیدا کرده و فرد با افسردگی مواجه می گردد. نتایج حاصل از این مطالعه بیانگر آن است که تجویز خوراکی متفورمین قادر است از کاهش حافظه، اضطراب و هم چنین افسردگی در موش¬های صحرایی مسن ممانعت به‌عمل آورد. در طی مرحله پیری از زندگی انسان، عملکردهای شناختی و سیناپسی افت پیدا می کنند که خود دلیلی جهت اختلالات عصبی در برخی از نواحی مغز می باشد (28, 27). با افزایش سن، حافظه به تدریج دچار نقص شده و کاهش می یابد (29). مطالعات حاکی از این مطلب اند که در افراد مسن به تدریج رسوب آمیلوئید بتا افزایش پیدا کرده و به تبع آن احتمال اختلال شناختی و زوال عقل افزایش خواهد یافت (31, 30). اختلالات اضطرابی سهم زیادی از اختلالات روانپزشکی افراد مسن را به خود اختصاص می دهند (10, 9). زنان مسن شیوع بیشتری از اختلالات خلقی و اضطرابی را نشان داده‌اند (32). در حالی که میزان خودکشی و مرگ و میر در مردان مسن سهم بیشتری را به خود اختصاص داد (34, 33). افسردگی در سنین بالا می تواند به عنوان یک بیماری روانی عود‌کننده در طول زندگی مطرح باشد. بیماری‌های همراه با پیری نظیر سرطان، پارکینسون و آلزایمر به‌شدت با افسردگی مرتبط هستند (35). متفورمین دارویی است که در درمان دیابت نوع دو مورد استفاده قرار می گیرد اما به نظر می رسد مکانیسم های دخیل در پیری را نیز مورد هدف قرار داده است. متفورمین در رابطه با پیری اعمال متفاوتی را سبب می شود از جمله این موارد می¬توان کاهش IGF-1 (36)، کاهش درون زای گونه‌های اکسیژن فعال (37) و فعال‌سازی کیناز فعال شده با  AMP(AMPK) را نام برد (38). هم چنین متفورمین قادر است تا بر التهاب (39)، اتوفاژی (40) و پیری سلولی مرتبط با افزایش سن اثرات مطلوبی از خود به نمایش بگذارد (41). مطالعات نشان می دهد متفورمین می‌تواند در کنار کنترل قند خون، بر عملکرد فیزیکی (نظیر حرکت)، وزن، سلامت قلب و عروقی، سلامت روانی (افسردگی و اختلالات شناختی) اثرات مطلوب داشته باشد (41). کاهش مدت زمان بی‌تحرکی مربوط به‌آزمون شنای اجباری در مطالعه حاضر نیز نشان داد که متفورمین اثرات مطلوبی بر کاهش سطح افسردگی در موش‌های صحرایی دارد. در راستای مطالعه ما N Shivavedi و همکارانش (2017) در موش های دیابتی افسرده نشان دادند که متفورمین اثرات افسردگی حاصل از بیماری را کاهش داد (42). CP Wang و همکاران وی (2017) دریافتند که تجویز متفورمین در افراد مسن دیابتی می تواند روند بیماری های همراه با سن نظیر بیماری های قلبی عروقی و افسردگی را آهسته کند و باعث کاهش آن ها گردد (43). مطالعه Sarkaki و همکاران (2015) نشان داد که متفورمین اثرات محافظت نورونی و تقویت حافظه دارد (44). Wang و همکاران (2012) با نشر مقاله خود بیانگر این موضوع بودند که متفورمین در حضور انسولین کافی باعث محافظت نورونی در مقابل پروتئین‌های تائو و آمیلوئید‌های بتا می شود و از طرفی با کاهش استرس‌های اکسیداتیو و آپوپتوز مسبب افزایش یادگیری و حافظه می گردد (45). نتایج مطالعه ما نیز به منظور ارزیابی حافظه کاری با تکیه بر آزمون ماز Y شکل نشان داد که متفورمین می‌تواند اثرات محافظت کننده سیستم عصبی و بهبود حافظه را در موش صحرایی مسن به‌وجود آورد. در بررسی¬ای که در موش¬های دیابتی انجام گرفت متفورمین توانست با حفاظت از هیپوکامپ مسبب بهبود حافظه گردد (47, 46). مقاله Leech و همکارانش (2019) بیان داشت که متفورمین در بهبود عملکرد ایسکمی مغزی/برقراری مجدد جریان خون موثر است و در بهبودی طولانی‌مدت پس از ایسکمی مغزی حائز اهمیت است (48). هم‌چنین در برخی مطالعات به اثرات ضد سرطانی و ضد‌التهابی متفورمین اشاره گردیده (50, 49) و حتی برای ترکیب با شیمی‌درمانی پیشنهاد شده است (52, 51). ذاکری و همکارانش (2019) نشان دادند که متفورمین می¬تواند در موش‌های اوارکتومی شده، مدلی از پیری، میزان اضطراب را به طور معنادار کاهش دهد و هم‌چنین بهبود حافظه و قدرت عضلانی را به‌همراه داشته باشد (22). فاطمی و همکاران (2018) پس از القای پیری توسط دی-گالاکتوز و تیمار با متفورمین مشاهده کردند که میزان اضطراب در آزمون ماز به‌علاوه ای شکل مرتفع کاهش معنی‌داری دارد. هم‌چنین به دنبال استفاده از متفورمین فعالیت آنزیم سوپراکسید دیس موتاز و سطح BDNF در مغز افزایش یافت (23). این مطالعه هم راستا با مطالعه فاطمی و همکارانش نشان داده که متفورمین در پیری می¬تواند میزان اضطراب را کاهش دهد.
نتیجه‌گیری
در مجموع داده های حاصل از این مطالعه نشان دادند که تجویز متفورمین به موش های صحرایی پیر از میزان رفتار شبه اضطرابی و افسردگی می کاهد. با توجه به این یافته ها، احتمالاً متفورمین می‌تواند به‌عنوان یک مورد پیشنهادی برای مطالعات بیشتر جهت ارتقا کیفیت زندگی در دوره پیری مورد بررسی و تحقیق بیشتر قرار گیرد. در این مطالعه بررسی های سلول و مولکولی جهت روشن‌سازی مکانیسم های احتمالی سودمند متفورمین انجام نگرفت. پیشنهاد می¬گردد در مطالعات هم‌راستای بعدی مکانیسم های سلولی و مولکولی مورد بررسی قرار داده شوند.
سپاس‌گزاری
نتایج بیان شده در این مقاله برگرفته از پایان‌نامه محمد پاک هاشمی است. این پژوهش با مساعدت مالی معاونت پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان به‌شماره قرارداد 97084/1/20/31 انجام گرفته است.
حامی مالی: معاونت محترم پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان
تعارض در منافع: وجود ندارد.

References:
1-Ladiges W, Van Remmen H, Strong R, Ikeno Y, Treuting P, Rabinovitch P, et al. Lifespan Extension inGenetically Modified Mice. Aging Cell 2009; 8(4): 346-52.
2-López-Otín C, Blasco MA, Partridge L, Serrano M, Kroemer G. The Hallmarks of Aging. Cell: 2013; 153(6): 1194-1217.
3-Kennedy BK, Berger SL, Brunet A, Campisi J, Cuervo AM, Epel ES, et al. Geroscience: Linking Aging to Chronic Disease. Cell 2014; 159(4): 709-13.
4-Coll‐Black S, Bhushan A, Fritsch K. Integrating Poverty and Gender into Health Programs: A Sourcebook for Health Professionals. Nursing & Health Sci 2007; 9(4): 246-53.
5-Sharifzadeh G, Moodi M, Akhbari H. Investigating Health Status of Older People Supported by Imam. Iranian J Ageing 2010; 5(3): 52-60. [Persain]
6-Sheldon TA, Parker H. Race and Ethnicity in Health Research. J Public Health 1992; 14(2): 104-10.
7- Sherina M, Rampal L, Mustaqim A. The Prevalence of Depression among the Elderly in Sepang, Selangor. Med J Malaysia 2004; 59(1): 45-9.
8-Asghari N. The Effects of Group Logotherapy on Decreasing the Degree of Depression in Female Olds. MDJDS 2012; 1(2): 31-8.
9-Schuurmans J, Van Balkom A. Late-Life Anxiety Disorders: A Review. Curr Psychiatry Rep 2011; 13(4): 267-73.
10-Schuurmans J, van Balkom A. Late-Life Anxiety Disorders: A Review. Current Psychiatry Reports 2011; 13(4): 267-73.
11-Ghafari M, Sharifirad GR, Zanjani S, Hassanzadeh A. Stress, Anxiety and Depression Levels among Elderly Referrals to Tehran Elderly Club. Iranian J Ageing 2012; 7(2): 53-9.
12-Stebbins GT, Carrillo MC, Dorfman J, Dirksen C, Desmond JE, Turner DA, et al. Aging Effects on Memory Encoding in the Frontal Lobes. Psychol Aging 2002; 17(1): 44-55.
13-Sachdev PS, Blacker D, Blazer DG, Ganguli M, Jeste DV, Paulsen JS, et al. Classifying Neurocognitive Disorders: The DSM-5 Approach. Nat Rev Neurol 2014; 10(11): 634-42.
14-Naveh-Benjamin M. Adult Age Differences in Memory Performance: Tests of an Associative Deficit Hypothesis. J Exp Psychol Learn Mem Cog 2000; 26(5): 1170-87.
15-Shaw RJ, Lamia KA, Vasquez D, Koo S-H, Bardeesy N, Depinho RA, Et al. The Kinase LKB1 Mediates Glucose Homeostasis in Liver and Therapeutic Effects of Metformin. Science 2005; 310(5754): 1642-6.
16-Sreenivasan Snima K, Pillai P, Mary Cherian A, V Nair S, Lakshmanan VK. Anti-Diabetic Drug Metformin: Challenges and Perspectives for Cancer Therapy. Current Cancer Drug Targets 2014; 14(8): 727-36.
17-Łabuzek K, Suchy D, Gabryel B, Bielecka A, Liber S, Okopień B. Quantification of Metforminby the HPLC Method in Brain Regions, Cerebrospinal Fluid and Plasma of Rats Treated with Lipopolysaccharide. Pharmacol Rep 2010; 62(5): 956-65.
18-Podhorecka M, Ibanez B, Dmoszyńska A. Metformin-Its Potential Anti-Cancer and Anti-Aging Effects. Postepy Hig Med Dosw 2017; 71(10): 170-75.
19-Ghadernezhad N, Khalaj L, Pazoki-Toroudi H, Mirmasoumi M, Ashabi G. Metformin Pretreatment Enhanced Learning and Memory in Cerebral Forebrain Ischaemia: The Role of the AMPK/BDNF/P70SK Signalling Pathway. Pharm Biol2016; 54(10): 2211-9.
20-Foretz M, Hébrard S, Leclerc J, Zarrinpashneh E, Soty M, Mithieux G, et al. Metformin Inhibits Hepatic Gluconeogenesis in Mice Independently of the LKB1/AMPK Pathway via a Decrease In Hepatic Energy State. J Clin Invest 2010; 120(7): 2355-69.
21-Sengupta P. The Laboratory Rat: Relating its Age with Human's. Int J  Prev Med 2013; 4(6): 624-30.
22-Zakeri M, Fatemi I, Zakeri MA, Alahtavakoli M. Investigate the Effect of Metforminon Some of the Behavioral Indicators in Ovariectomized Middle Aged Mice. SSU_Journals 2019; 26(10): 910-20.
23-Fatemi I, KhaluoiA, Kaeidi A, Shamsizadeh A, Heydari S, Allahtavakoli M. Protective Effect of Metforminon D-Galactose-Induced Aging Model inMice. Iran J Basic Med Sci 2018; 21(1): 19-25.
24-Tamijani SMS, Beirami E, Ahmadiani A, Dargahi L. Effect of Three Different Regimens of Repeated Methamphetamine on Rats’ Cognitive Performance. Cogn Process 2018; 19(1): 107-15.
25-Pellow S, Chopin P, File SE, Briley M. Validation of Open: Closed Arm Entries inan Elevated Plus-Maze as a Measure of Anxiety in the Rat. J Neurosci Methods 1985; 14(3): 149-67.
26-Slattery DA, Cryan JF. Using the Rat Forced Swim Test to Assess Antidepressant-Like Activity in Rodents. Nat Protocols 2012; 7(6): 1009-14.
27-Zhang X-L, An L-J, Bao Y-M, Wang J-Y, Jiang B. D-Galactose Administration Induces Memory Loss and Energy Metabolism Disturbance in Mice: Protective Effects of Catalpol. Food Chem Toxicol 2008; 46(8): 2888-94.
28-Morrison JH, Hof PR. Life and Death of Neurons in the Aging Brain. Science 1997; 278(5337): 412-9.
29-Hardy R, Kuh D. Change in Psychological and Vasomotor Symptom Reporting During the Menopause. Soc Sci Med 2002; 55(11): 1975-88.
30-Wend K, Wend P, Krum SA. Tissue-Specific Effects of Loss of Estrogen During Menopause and Aging. Front Endocrinol 2012; 3: 19.
31-Sipilä S, Taaffe Dr, Cheng S, Puolakka J, Toivanen J, Suominen H. Effects of Hormone Replacement Therapy and High-Impact Physical Exercise on Skeletal Muscle in Post-Menopausal Women: A Randomized Placebo-ControlledStudy. ClinSci 2001; 101(2): 147-57.
32-Riecher-Rössler A. Sex and Gender Differences in Mental Disorders. The Lancet Psychiatry 2017; 4(1): 8-9.
33-Steel Z, Marnane C, Iranpour C, Chey T, Jackson JW, Patel V, Et al. The Global Prevalence of Common MentalDisorders: A Systematic Review and Meta-Analysis 1980–2013. Int J Epidemiol 2014; 43(2): 476-93.
34-De Leo D, Kõlves K. Suicide at Very Advanced Age–The Extremes of the Gender Paradox. Hogrefe Publishing 2017; 38(6): 363-66.
35-Blazer DG. Depression in Late Life: Review and Commentary. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 2003; 58(3): M249-M65.
36-Liu B, Fan Z, Edgerton SM, Yang X, Lind SE, Thor AD. Potent Anti-Proliferative Effects of MetforminOn Trastuzumab-Resistant Breast Cancer Cells via Inhibition of Erbb2/IGF-1 Receptor Interactions. Cell Cycle 2011; 10(17): 2959-66.
37-Batandier C, Guigas B, Detaille D, El-Mir M, Fontaine E, Rigoulet M, et al. The ROS Production Induced by a Reverse-Electron Flux at Respiratory-Chain Complex 1 is Hampered by Metformin. J Bioenerg Biomembr 2006; 38(1): 33-42.
38-Cho K, Chung JY, Cho SK, Shin H-W, Jang I-J, Park J-W, Et al. Antihyperglycemic Mechanism of Metformin Occurs via the AMPK/Lxrα/POMC Pathway. Sci Rep 2015; 5: 8145.
39-Saisho Y. Metformin and Inflammation: Its Potential Beyond Glucose-Lowering Effect.  Metab Immune Disord Drug Targets 2015; 15(3): 196-205.
40-Song YM, Lee YH, Kim JW, Ham DS, Kang ES, Cha BS, et al. Metformin Alleviates Hepatosteatosis by Restoring SIRT1-Mediated Autophagy Induction via an AMP-Activated Protein Kinase-Independent Pathway. Autophagy 2015; 11(1): 46-59.
41-Jadhav KS, Dungan CM, Williamson DL. Metformin Limits Ceramide-Induced Senescence in C2C12 Myoblasts. Mech Ageing Dev 2013; 134(11-12): 548-59.
42-Shivavedi N, Kumar M, Tej GNVC, Nayak PK. Metformin and Ascorbic Acid Combination Therapy Ameliorates Type 2 Diabetes Mellitus and Comorbid Depression in Rats. Brain Res 2017; 1674: 1-9.
43-Wang C-P, Lorenzo C, Habib SL, Jo B, Espinoza SE. Differential Effects of Metforminon Age Related Comorbidities in Older Men with Type 2 Diabetes. J Diabetes Complications 2017; 31(4): 679-86.
44-Sarkaki A, Farbood Y, Badavi M, Khalaj L, Khodagholi F, Ashabi G. Metformin Improves Anxiety-Like Behaviors Through AMPK-Dependent Regulation of Autophagy Following Transient Forebrain Ischemia. Metab Brain Dis 2015; 30(5): 1139-50.
45-Wang J, Gallagher D, Devito LM, Cancino GI, Tsui D, He L, et al. Metformin Activates an Atypical PKC-CBP Pathway to Promote Neurogenesis and Enhance Spatial Memory Formation. Cell Stem Cell 2012; 11(1): 23-35.
46-Ge X-H, Zhu G-J, Geng D-Q, Zhang H-Z, He J-M, Guo A-Z, et al. Metformin Protects the Brain Against Ischemia/Reperfusion Injury Through PI3K/Akt1/JNK3 Signaling Pathways in Rats. Physiol Behav 2017; 170: 115-23.
47-Oliveira WH, Nunes AK, França MER, Santos LA, Lós DB, Rocha SW, et al. Effects of Metforminon Inflammation and Short-Term Memory in Streptozotocin-Induced Diabetic Mice. Brain Res 2016; 1644: 149-60.
48-Leech T, Chattipakorn N, Chattipakorn SC. The Beneficial Roles of Metforminon the Brain with Cerebral Ischaemia/Reperfusion Injury. Pharmacol Res 2019; 146: 104261.
49-Zingales V, Distefano A, Raffaele M, Zanghi A, Barbagallo I, Vanella L. Metformin: A Bridge Between Diabetes and Prostate Cancer. Front Oncol 2017; 7: 243.
50-Zaidi S, Gandhi J, Joshi G, Smith NL, Khan SA. The Anticancer Potential of Metforminon Prostate Cancer. Prostate Cancer Prostatic Dis 2019: 22(3): 351-61.
51-Colquhoun A, Venier N, Vandersluis A, Besla R, Sugar L, Kiss A, et al. Metformin Enhances the Antiproliferative and Apoptotic Effect of Bicalutamide in Prostate Cancer. Prostate Cancer Prostatic Dis 2012; 15(4): 346-52.
52-Iliopoulos D, Hirsch HA, Struhl K. Metformin Decreases the Dose of Chemotherapy for Prolonging Tumor Remission in Mouse Xenografts Involving Multiple Cancer Cell Types. Cancer Res 2011; 71(9): 3196-201.