ماهنامه علمی پ‍ژوهشی

مقدمه
ملانوما (گونه‌ای از سرطان بوده) که قدرت تهاجم بالا و متاستاز سریع به سایر اندام‌ها را دارد (1). دوره بقای افراد مبتلا به ملانومای متاستازی حدود 6 الی 10ماه است و کمتر از 10% آن‌ها می‌توانند تا 5 سال زنده بمانند (2). عوامل متعددی در سرطانی شدن ملانوسیت ها و ایجاد ملانوما دخیل هستند. بیش از 65% ملانوما وابسته به نورآفتاب است و این عامل مهم‌ترین عامل در ایجاد ملانوما می‌باشد، عوامل دیگر مانند پوست روشن، موی بور یا قرمز، خال‌های بزرگ مادرزادی، سرکوب سیستم ایمنی، چند شکلی‌های ژنی، مصرف الکل، کک و مک‌های متعدد، فاکتورهای ژنتیکی و پیشینه خانوادگی نیز در ایجاد این بیماری دخیل هستند (3). فاکتورهای زیادی وجود دارد که پوست در معرض آن‌ها قرار می‌گیرد از جمله دود، میکروارگانیسم‌ها و یا اشعه ماوراء بنفش که می‌توانند باعث ایجاد پاسخ‌های بیولوژیکی شده و از طریق تولید گونه‌های اکسیژن فعال (Reactive Oxygen Species) منجر به آسیب پوست شوند (4). در مقابل این عوامل، آنتی اکسیدان‌ها ترکیب‌هایی هستند که بـه مهــار بســیاری از واکنش‌های اکسیداســیون کــه توســط رادیکال‌های آزاد ایجـاد مـی‌شـوند، کمـک نمـوده و بـدین وسیله آسیب وارده به سلول‌ها و بافت‌ها را مهار کـرده یـا بـه تأخیر می‌اندازنـد. از جملـه مکانیسـم‌های عملکـردی آن‌هـا واکنش جمع آوری گونه‌ای رادیکال آزاد اکسیژن و نیتــروژن مــی‌باشــد (5). شواهد گسترده ای برای استفاده از آنتی‌اکسیدان‌ها در سرطان وجود دارد (6). ارزش پتانســیلی آنتــی اکســیدان‌ها، محققــان را بر آن داشته تا بــه جستجوی ترکیب‌های طبیعی با فعالیت آنتی اکسیدانی بـالا و سمیت کم بپردازند. مطالعـات اخیـر نشـان داده کـه تعــدادی از محصــولات گیــاهی شــامل: پلــی فنــل‌هــا، فلاونوئید‌ها، کومارین‌ها، کورکومین‌هـا، تـرپن‌هـا و انـواع عصاره‌های گیاهی، فعالیت آنتـی اکسـیدانی از خـود نشـان می‌دهند (7). امروزه مزیت استفاده از داروهای گیاهی بر همگان آشکار است که این گونه داروها عوارض بسیار ناچیزی دارند، در صورتی که داروهای شیمیایی عوارض متعددی دارند. در جهان ماشینی امروز، محیط پیرامون انسان‌ها مملو از مواد جهش زا و سرطان زا می‌باشد اما گیاهان با به دام انداختن رادیکال‌های آزاد و داشتن خاصیت آنتی‌اکسیدانی در جلوگیری از ایجاد چنین بیماری‌هایی بسیار مؤثر می باشند (8). از سویی دیگر به علت محدودیت‌های مدیریت فعلی سرطان (جراحی، شیمی درمانی و پرتودرمانی)، داروهای سایتوتوکسیک موجود در مکان‌های خاص به راحتی در دسترس کشورها نیستند و هم‌چنین استفاده از آن‌ها با تعدادی از عوارض ناخواسته و عوارض جانبی همراه است. لذا، بخش عمده‌ای از بیماران ترجیح می‌دهند که به حمایت از مکمل و طب جایگزین روی آورند (9). از جمله گیاهان دارویی که در ایران تاکنون توجه زیادی به آن نشده است، آناناس می‌باشد. آناناس با نام علمی Ananas comosus ونام انگلیسی pineapple متعلق به خانواده برومولیاسه وزیر خانواده برومولویده می‌باشد. این میوه یکی از پرطرفدارترین میوه‌های استوایی است (10). از نظر ترکیبات شیمیایی در هر صد گرم قسمت قابل مصرف میوه رسیده وخام به‌صورت متوسط: 85گرم آب، 4/ 0گرم پروتین، 0/2 گرم چربی، 13 گرم مواد قندی، 17 میلی گرم کلسیم، 8 میلی گرم فسفر، 0.5میلی‌گرم آهن، 1 میلی‌گرم سدیم، 146 میلی‌گرم پتاسیم، 09میلی‌گرم تیامین، 0/03 میلی‌گرم ریبوفلاوین، 0/2میلی‌گرم نیاسین، آنزیم برومیلین، وانیلین، اسید‌های آزاد آلی، 17 میلی‌گرم ویتامین C ، 70 واحد بین المللی ویتامین A، B و B2 وجود دارد. آنزیم برومیلین به دست آمده از عصاره آناناس به صورت گسترده در طب سنتی استفاده می‌شود این ماده علاوه بر این موارد، دارای فعالیت‌هایی نظیر تنظیم کننده سیستم ایمنی، اثرات ضد‌ التهابی (11)، و اثرات ضد سرطانی است. رئیسی و همکاران در سال 1395، اثرات ضدسرطانی آناناس را بر سرطان پستان بررسی نموده و به نتایج ارزشمندی در راستای نابودی این سلول‌ها دست یافتند (2). با توجه به قابلیت‌های برومیلین و تعداد اندک مطالعات انجام شده پیرامون سلول‌های سرطانی، هنوز مطالعات بیشتری لازم است تا بتوان قابلیت‌های این ترکیب را بررسی کرد. از اصلی‌ترین مشکلاتی که برای درمان سرطان وجود دارد این است که داروهای درمانی در بافت‌های توموری باقی نمی‌مانند و این داروها بافت‌های سالم بدن را نیز تحت تاثیر قرار می‌دهند (12). درمآن‌های مختلفی که امروزه برای سرطان وجود دارد مثل پرتودرمانی و یا سایر داروهای رایج، همگی برای سلول‌های سالم بدن نیز سمی هستند و علاوه بر هزینه‌های بالا عوارض جانبی بالایی دارند (13). بنابراین احساس می‌شود که نیاز مبرمی به روش‌های جدید برای درمان سرطان به عنوان روش‌های درمانی هدفمند سرطان وجود دارد که بتواند جایگزین خوبی برای روش‌های شیمی‌درمانی فعلی باشد (14). به کمک نانوذره‌ها می‌توان داروها را به‌صورت هدفمند به سلول‌های توموری انتقال داد و به این ترتیب فقط این سلول‌ها را تحت تاثیر قرار داد، ضمن اینکه به کمک نانوداروها میتوان مشکلات حلالیت برخی داروهای ضد سرطان را نیز حل کرد، انواع داروهای هیدروفوب یا هیدروفیل را انتقال داد و نیز از ایجاد مقاومت دارویی در سلول‌های سرطانی جلوگیری کرد و نیز نانوذره ها می توانند مدت زمان بیشتری در تماس با سلول‌های توموری باشند و اثربخشی بیشتری داشته باشند (‌14،12). سیستم‌های تحویل دارو با اندازه نانو جزء بهترین ابزارها برای افزایش اختصاصیت دارو و نیز کاهش سمیت سیستمیک آن می‌باشند (15). لیپوزوم‌ها وزیکول‌های کروی هستند که می‌توانند یک یا چند دولایه لیپیدی داشته باشند. ساختار این غشا‌های لیپیدی ممکن است از لیپیدی‌های طبیعی یا مصنوعی باشند. این نانو ذره‌ها می‌توانند دارو‌های هیدرو‌فیل را در هسته آبی خود و دارو‌های هیدروفوب را در دو لایه لیپیدی خود محصور کنند و به این ترتیب هر دو نوع دارو را انتقال دهند. از طرفی زیست سازگاری و زیست تجزیه‌پذیری این نانو ذره‌ها سبب شده تا آن‌ها حامل‌های کم نظیری برای انتقال ترکیبات دارویی باشند. لیپوزوم‌ها براساس نوع طراحی که شده‌اند می‌توانند اندازه‌ای در حدود چند ده نانومتر تا چند میکرومتر داشته باشند (16،17). از دیگر مزایای لیپوزوم‌ها می‌توان به زیست سازگار بودن آن‌ها در بدن، عدم برانگیختن پاسخ ایمنی، ایجاد بیشترین اثر درمانی به علت کاهش سمیت دارو، افزایش پایداری لیپوزوم‌های حاوی دارو و کاهش تماس بافت‌های حساس با داروهای سمی را نام برد (18). هدف از انجام این مطالعه، ارزیابی قابلیت نانوحامل‌های لیپوزومی در حفظ سمیت و رسانش عصاره میوه آناناس در شرایط کشت سلولی سلول‌های سرطان پوست، رده A375 می باشد.
روش بررسی
عصاره‌گیری از میوه آناناس
میوه آناناس تهیه شده و پس از شسته شدن به حلقه‌های نازک برش زده شد و در مکان سایه روشن به دور از آلودگی خشک شد. سپس از میوه خشک شده، پودر یکنواخت تهیه گردید. جهت عصاره گیری میوه آناناس از روش خیساندن در دمای 4 درجه سانتیگراد استفاده شد. به ازای هر 7 گرم پودر آناناس، 50 میلی‌لیتر اتانول 85% استفاده شد. عصاره حاصله در بن ماری 37 درجه سانتیگراد قرار داده شد تا حلال به طور کامل تبخیر شود. عصاره خشک بدست آمده تا زمان استفاده، درون یخچال نگهداری شد.
رسم نمودار استاندارد عصاره میوه آناناس در ایزوپروپیل و بافر PBS
جهت رسم منحنی استاندارد و به دست آوردن معادله خط، غلظت‌های مختلفی از عصاره تهیه و جذب آن‌ها در طول موج800-200 نانومتر اندازه‌گیری شد. سپس با توجه به غلظت‌های مورد استفاده و جذب مربوطه، منحنی استاندارد با استفاده از نرم‌افزار اکسل رسم شده و معادله آن جهت تعیین غلظت های مجهول مورد استفاده قرار گرفت. لازم به ذکر است که در دو بافر PBS و ایزوپروپیل، به ترتیب جهت محاسبه رهایش و محاسبه لود، منحنی استاندارد به دست آورده شد.
تهیه نانوذره لیپوزومی حاوی عصاره میوه آناناس
لیپوزوم حاوی عصاره آناناس به روش آب پوشانی لایه نازک و با ترکیبی شامل فسفاتیدیل‌کولین سویا (70%)، کلسترول (30%) و پلیاتیلن‌گلیکول (PEG) (2%) و عصاره آناناس (2‌میلی‌گرم) تهیه شد. ابتدا فسفاتیدیل کولین سویا، کلسترول و PEG در حلال کلروفرم و در دمای 45 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 دقیقه بر روی روتاری همگن شده و تحت شرایط خلاء، نیم خلاء در مدت زمان 45 دقیقه، فیلم نازک خشک تهیه شد. فیلم حاصل به مدت 24 ساعت در یخچال قرار داده شد تا تمامی کلروفرم باقی‌مانده تبخیر شود. سپس عمل هیدراته کردن با افزودن محلول حاوی عصاره میوه (2 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر به بالن اضافه و طی مدت 50-45 دقیقه و در دمای 50 درجه سانتی‌گراد انجام شد. سپس نانو ذرات تهیه شده با استفاده از سونیکیت پروبی برای مدت یک ساعت‌،کاهش سایز داده شد. سامانه آماده شده ابتدا از فیلتر 0/4 و سپس 0/2عبور داده شد. در این مرحله نانو ذره لیپوزومی حاوی دارو بدست آورده شد. سامانه حاوی عصاره بدست آمده شامل لیپوزوم حاوی دارو و مقداری نیز داروی آزاد موجود در محیط است که بایستی با ایجاد شیب غلطت مناسب داروی آزاد خارج از سامانه جداسازی شود. بدین منظور از روش کیسه دیالیز استفاده شد.
بازده درون‌گیری نانو حامل‌های لیپوزومی
برای بررسی میزان دارو (عصاره آناناس) درون حامل لیپوزومی سنتز شده از ایزوپروپیل به عنوان حل کننده غشای لیپوزوم‌ها و برون‌ریزی داروی انباشت شده استفاده شد. لذا رقت های متفاوت حجمی (V/V) ایزوپروپیل: لیپوزوم حاوی دارو (1:100،1:40،1:20،1:10،1:5) تهیه شد، و پس از قرار دادن رقتهای تهیه شده به مدت 1 ساعت درون یخچال (جهت تاثیرگذاری کامل ایزوپروپیل بر روی سامانه)، با استفاده از دستگاه اسپکتروسکوپی، جذب آنها در طول موج 400-200 نانومتر خوانده و غلطت داروی انباشت شده درون نانو حامل‌های لیپوزومی با استفاده از معادله کالیبراسیون عصاره – ایزوپروپیل محاسبه گردید. با استفاده از رابطه ذیل میزان درون‌گیری دارو درون حامل محاسبه شد.
×100

تعیین درصد برهایش عصاره میوه آناناس در نانو حامل لیپوزومی
تعیین میزان رهایش عصاره از نانولیپوزوم با تکنیک انتشار انجام شد. جهت شبیه سازی رهایش دارو از حامل لیپوزومی در محیط in vivo از PBS و روش کیسه دیالیز استفاده شد. در زمان‌های مشخص (0/5، 1، 3، 5، 7، 12، 24،48، 72 ساعت) نمونه‌برداری از محیط اطراف کیسه دیالیز صورت گرفته و در انتها با بهره‌برداری از معادله کالیبراسیون عصاره -PBS، نسبت به محاسبه غلظت داروی آزاد شده در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و =7 PH= جهت بررسی رهایش برای سلول سالم و در دمای 42 درجه سانتی‌گراد و54/4pH=  جهت بررسی رهایش برای سلول سرطانی در زمآن‌های مختلف و رسم نمودار آن اقدام شد.
آنالیز طیف‌سنجی مادون قرمز فوریه ( FTIR)
برای بررسی گروه‌های عاملی و برهمکنش سطح نانولیپوزوم‌ حاوی دارو از دستگاه طیف‌سنجی مادون ‌قرمز استفاده گردید. طیف‌سنجی مادون قرمز بر اساس جذب تابش و بررسی جهش‌های ارتعاشی مولکول‌ها و یون‌های چند اتمی صورت می‌گیرد. این تست به‌عنوان روشی خوب، برای تعیین ساختار و اندازه‌گیری گونه های شیمیایی و نیز برای شناسایی ترکیبات آلی، مورد استفاده قرار می‌گیرد. جهت اطمینان از حضور ترکیبات بیوشیمیایی در عصاره آناناس به‌دست آمده و لیپوزوم حاوی عصاره از روش FTIR استفاده شد. طیف FTIR به منظور بررسی گروه‌های عاملی محلول عصاره، نانولیپوزوم حاوی عصاره و نانولیپوزوم خالی در محدوده طول موجcm-14000-400 اسکن شدند.
تصویر‌برداری از نانولیپوزوم‌ها
قبل از کاربرد واژه لیپوزوم ضروری است که از شکل ساختار تولید شده و برخی خصوصیات آن اطمینان حاصل شود. بهترین روش برای بررسی ساختار، مشاهده میکروسکوپی است. در این پژوهش جهت بررسی مورفولوژی لیپوزوم‌های ساخته شده از میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM) (مدل JPK، ساخت آلمان) استفاده شد.
تعیین اندازه نانوذرات و ضریب پراکندگی
پراکندگی دینامیکی نور یا DSL تکنیکی برای اندازه گیری اندازه ذرات یا مولکول‌ها در محدوده میکرون تا نانومتر در داخل محلول است. در این تکنیک نور لیزر به ذراتی که در داخل محلول و دارای حرکت براونی هستند تابیده می‌شود و نور پس از برخورد با این ذرات دچار تفرق با شدت‌های مختلف می‌شود. سپس این نور توسط دستگاه آنالیز می‌شود. کابردهای عمومی تکنیک DLS عبارتند از تعیین اندازه ذرات و ترسیم نمودار پراکندگی آن‌ها و اندازه‌گیری پتانسیل زتا. محدوده توزیع اندازه ذرات و پیک اندازه آن‌ها با استفاده از دستگاه تفرق دینامیکی نور (DLS) تعیین می‌شود. بدین منظور از دستگاه نانوسایزر  (HORIBA SZ-100)استفاده شد. در نتیجه اندازه‌ نانولیپوزوم‌های خالی و حاوی دارو با بررسی نتایج حاصل از این دستگاه به‌دست آمد.
تعیین پتانسیل زتای نانولیپوزوم‌ها
پتانسیل زتای یک ذره، بار کلی است که یک ذره در یک محیط ویژه کسب می‌کند و این خاصیت از ویژگی‌های فیزیکی ذرات است و پارامتر خوبی برای نشان دادن میان کشش مغناطیسی بین ذرات به شمار می‌رود. میزان بار سطحی و پتانسیل زتای نانولیپوزوم‌ها ی حامل دارو ( عصاره) از طریق دستگاه زتا سایزر (HORIBA SZ-100)در دمای 25 درجه سانتی‌گراد اندازه‌گیری شد.
خاصیت آنتی‌اکسیدانی (DPPH)
جهت بررسی خاصیت آنتی‌اکسیدانی از روش به دام‌اندازی رادیکال آزاد 2و 2 دی فنیل -1- پیکریل هیدرازیل (2-2 diphenyl-1- picrylhydrazil) (DPPH) استفاده شد. تغییر رنگ ایجاد شده به روش اسپکتروفتومتری اندازه گیری شد. 1 میلی‌لیتر از محلول 1/0 میلی مولارDPPH به 1 میلی‌لیتر از عصاره و نانولیپوزوم حاوی عصاره در رقت‌های (1، 0/7، 0/5، 0/2، 0/08 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) اضافه و به خوبی تکان داده شده و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق و مکان تاریک قرار داده شد. سپس جذب مخلوط در طول موج 517 نانومتر با بلانک متانول و محلول DPPH اندازه‌گیری شده و مهار رادیکال‌های آزاد با فرمول زیر محاسبه گردید:

در فرمول مربوط به این تست،I% نشان دهنده مهار رادیکال آزاد DPPH و منظور از جذب بلانک همان جذب نمونه کنترل می‌باشد.
تعیین سمیت سلولی و میزان بقاء
سلول‌های A-375 جزء رده های سلولی ملانومای انسانی از نوع سلول‌های چسبان است. این رده سلولی به صورت فلاسک از مرکز ذخایر ملی ژنتیک ایران (تهران، ایران) تهیه شده و صحت سلول‌ها و هم‌چنین عدم آلودگی فلاسک تایید شد. برای کشت سلول‌ها از محیط کشت DMEM High Glucose غنی شده با 10% FBS و 2میلی مولار L-Glutamine، استفاده شده و سلول‌ها در انکوباتور (37 درجه سانتیگراد با 5% CO2 و رطوبت 95%) نگهداری شدند. پس از انجام 3 پاساژ موفق، سلول‌ها به تعداد 104 سلول در هر چاهک از پلیت 96 تایی کشت داده شدند. پس از 24 ساعت از کشت سلول‌های A375، سلول‌های A-375 در معرض غلظت‌های مختلفی از عصاره آناناس، لیپوزوم‌های فاقد عصاره و لیپوزوم‌های حاوی عصاره، طی مدت زمان 24، 48، 72 و 96 ساعت قرار داده شدند. سپس، جهت ارزیابی سمیت سلولی القا شده توسط ترکیبات فوق و میزان درصد بقای سلول‌ها، از آزمون MethyThiazolTetrazolium (MTT) استفاده شد. پس از گذشت زمان‌های مورد نظر به هر چاهک مقدار کافی محلول 5 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر MTT اضافه شد. پلیت‌ها به مدت 3 ساعت انکوبه شدند و پس از طی زمان لازم محیط کشت حاوی MTT به دقت خارج شده و به هر چاهک 100 میکرولیتر DMSO اضافه گردید تا بلورهای فورمازان حاصل حل شوند. پس از گذشت مدت زمان 150 دقیقه جذب نوری در 570 نانومتر توسط دستگاه الایزا ریدر (BioTek ساخت شرکت ویراژن) خوانده شد. درصد بقای سلول‌ها با استفاده از فرمول زیر محاسبه گردید.

تجزیه و تحلیل آماری
نتایج تست‌ها پس از 4 بار تکرار و به صورت Mean ± SD ارائه شده است. محاسبه غلطت IC50 با استفاده از نرم افزار Origin انجام گردید. آنالیزهای آماری با استفاده از نرم‌افزار   SPSS Version. 22انجام شده و از تست‌های آماری Duncan و Student's T-test برای تحلیل آماری داده‌ها استفاده گردید.
ملاحظات اخلاقی
پروپوزال این تحقیق توسط دانشگاه علم و هنر یزد تایید شده است (کد اخلاق IR.SSU.RSI.REC.1398.038)
نتایج
راندمان بارگیری و بررسی پروفایل رهایش عصاره
راندمان انکپسولاسیون نانولیپوزوم‌های حاصل از این پژوهش با بررسی نمودار کالیبراسیون عصاره میوه آناناس در ایزوپروپیل (نمودار 1)، حدود 40 درصد بوده است. هم‌چنین با استناد به نمودار کالیبراسیون عصاره میوه آناناس در بافر PBS ( نمودار 1)، نمودار رهایش عصاره از نانوسامانه لیپوزومی در دمای°C 37 و °C42 رسم گردید (نمودار 1). با توجه به نمودار رهایش، نانوسامانه دارای عصاره در دمای 0C 37 و 0C42 آهسته رهش با رهایش کنترل شده بوده است.
 

نمودار 1 (a) : نمودار کالیبراسیون آناناس با ایزوپروپیل، (b) نمودار کالیبراسیون آناناس با بافر PBS، (c) نمودار رهایش عصاره میوه آناناس از نانو سامانه لیپوزومی در دمای C 37 و  C 42
 
نتایج حاصل از آنالیز طیف مادون قرمز (FTIR)
آنالیزFTIR عصاره آناناس ( تصویر 1. a) نشان میدهد که طول موج cm^-13435/87مشخصه گروه OH ، طول موج cm^-11639/69 مشخصه C=C  که متعلق به گروه آلکن‌ها هستند، طول موج cm^-1688/63 نشان دهنده آروماتیک‌ها است. هم‌چنین با بررسی آنالیز  FTIRلیپوزوم بلانک (تصویر1.b) و لیپوزوم حاوی عصاره آناناس (تصویر 1.c)، مشخص میشود که طول موج cm^-13279/19 مشخصه گروه عاملی OH ، طول موج‌های cm^-13010/49 و cm^-12923/58و cm^-1 2853/33 مشخصه پیوند C-H از گروه آلکان‌ها، طول موج cm^-11737/76 مشخصه پیوندOC=، پیک‌های موجود در ناحیه 1300-1000 مربوط به گروه C-O، طول موج cm^-1874/37 و 721/20 مشخصه حلقه‌های آروماتیک C-H است. همان‌طور که مشاهده می‌شود عدم وجود هیچ‌گونه پیک اضافی در سامانه‌های حاوی عصاره نشان دهنده عدم تداخل و نیز عدم تشکیل پیوند‌های کووالانسی عصاره با سامانه‌های لیپوزومی مربوطه است و این مهم نشان می‌دهد که عصاره موقعیت دارویی خود را به خوبی حفظ کرده است (تصویر 1).
تصویر برداری از نانولیپوزوم ها با میکروسکوپ نیروی اتمی
با توجه به تصاویر AFM نانوذرات لیپوزومی آناناس (تصویر 2)، لیپوزوم‌های تشکیل شده دارای مورفولوژی کروی با حدود کاملاً مشخص می‌باشند و شکل‌ها نشان می‌دهد که نانو ذرات حاوی آناناس از نظر مورفولوژی سطحی (کروی بودن، صافی و کلوخه نشدن) نرمال هستند.
 

تصویر1: (a) آنالیز FTIR عصاره خالص آناناس، (b) آنالیز FTIR سامانه¬لیپوزومی خالی (بلانک)، (c) آنالیز FTIR نانولیپوزوم حاوی عصاره آناناس

تصویر 2: تصاویرAFM از نانوسامانه لیپوزومی حاوی عصاره میوه آناناس
 
اندازه و بار سطحی نانوسامانه بلانک و نانوسامانه حاوی عصاره
اندازه نانوذره لیپوزومی در این پژوهش قبل از لود عصاره 82/4 نانومتر بوده که بعد از لود عصاره آناناس، سایز نانودره افزایش یافته و به مقدار 89/9 نانومتر رسیده است که این افزایش سایز می‌تواند نشان دهنده بارگذاری عصاره در نانو ذره باشد. لیپوزوم‌ها به علت دارا بودن ساختار فسفولیپیدی به صورت عادی دارای بار منفی هستند. شارژ سطحی نانولیپوزوم تنها (بلانک) توسط دستگاه زتاسایزر اندازه‌گیری شد. میانگین بار به‌دست آمده 35- بوده که با توجه به این مقدار شارژ سطحی آنیونی می‌باشد. بعد از لود عصاره آناناس پتانسیل زتای لیپوزوم به 8/8- رسیده و افزایش نشان داده که این مهم اشاره به بار مثبت عصاره آناناس دارد.
بررسی خواص آنتی‌اکسیدانی (تست  (DPPHبرای عصاره میوه آناناس و نانوسامانه حاوی عصاره میوه آناناس
همان‌گونه که در نمودار (2) مشخص است ظرفیت آنتی‌اکسیدانی عصاره خالص آناناس و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی نانوسامانه حاوی عصاره آناناس با غلظت استفاده شده در این تست رابطه مستقیم دارند یعنی در غلظت‌های بالاتر میزان DPPH بیشتر است، اما این مهم حائز اهمیت است که میزان تست DPPH نانوسامانه حاوی عصاره نسبت به عصاره تنها در غلظت‌های مشترک، بیشتر است.
 

نمودار 2: تست بررسی خواص آنتی اکسیدانی عصاره میوه آناناس و لیپوزوم حاوی عصاره میوه آناناس.
بررسی سمیت سلولی (MTT) عصاره میوه آناناس و نانوسامانه حاوی عصاره آناناس
نتایج حاصل از سمیت سلولی نشان می‌دهد که سمیت عصاره آزاد و لیپوزومه وابسته به غلظت و زمان است، به گونه‌ای که کمترین بقای سلول‌های سرطانی رده A375 تیمار شده با عصاره میوه آناناس و نانوذره لیپوزومی حاوی این عصاره مربوط به غلظت 1000میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر است و با کاهش غلظت عصاره و نانولیپوزوم های حاوی عصاره از میزان سمیت کاسته و بر میزان بقای سلول‌ها افزوده می‌شود. با توجه به نمودار بقای سلول‌های رده A375 تحت تاثیر نانولیپوزوم‌های بلانک (نمودار 3a) مشخص می‌شود که میزان بقای سلول‌ها در غلظت‌های مختلف لیپوزوم‌های بلانک بیش از 90 درصد است که خود نشان دهنده عدم سمیت نانولیپوزوم‌های فاقد عصاره بر سلول‌ها است. طبق نمودار 4b و 4c کمترین بقای سلول‌ها تحت تاثیر عصاره آزاد و عصاره لیپوزومه مربوط به بیشترین غلظت تیمار شده در بازه زمانی 96 ساعت می باشد که غلظت 1000 میکروگرم بر میلی‌لیتر برای تیمار با عصاره آزاد و غلظت 250 میکروگرم بر میلی‌لیتر برای تیمار با عصاره لیپوزومه است، میزان بقای سلول‌ها در بازه زمانی 96 ساعت در غلظت مشترک 250 میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر برای تیمار با عصاره آزاد برابر 29 درصد و برای تیمار با عصاره لیپوزومه برابر 24 درصد است که دارای تفاوت معناداری (p< 0/05) است. هم‌چنین بیشترین درصد زنده‌مانی سلول‌های تیمار شده با عصاره آزاد و لیپوزومه طی کمترین غلظت استفاده شده یعنی غلظت 2/5 میگروگرم بر میلی‌لیتر برا تیمار با عصاره آزاد و غلظت 5 میکروگرم بر میلی‌لیتر برای تیمار با عصاره لیپوزومه در بازه زمانی 24 ساعت بوده که به‌ترتیب برای عصاره آزاد و لیپوزومه برابر 97 و 77 درصد می‌باشد که این ارقام دارای تفاوت معناداری (p< 0/05)می‌باشند.
 
نمودار 3) میزان بقای سلول.  (a)سلول‌های تیمار شده با لیپوزوم بلانک در سه غلظت (1000و 500و 250 µg/ml)، (b) سلول‌های تیمار شده با غلظت‌های مختلف عصاره آناناس، (c) سلول‌های تیمار شده با غلظت‌های مختلف لیپوزوم حاوی عصاره آناناس. اختلافات مشاهده شده در میزان بقا در میان غلظت‌های مختلف هر تیمار و تیمارهای مختلف معنی‌دار می‌باشند (p< 0/05)
بحث
با توجه به فراگیر بودن ملانوما خصوصاً در مناطق آفتاب گیر چه در ایران و چه در خارج از کشور و عوارض استفاده از داروهای شیمیایی و هم‌چنین نگرانی اقتصادی مربوط به آن نیاز مبرمی برای استفاده از روش‌های درمانی نوین ایجاد کرده است. امروزه کارایی نانوذرات در انتقال موثرتر دارو و درمان بهتر سرطان در سطح In vitro وIn vivo تایید شده است. از سوی دیگر بررسی ترکیبات موجود در عصاره‌های گیاهی و تأیید اثرات ضدسرطانی آن‌ها محققان را بر آن داشته تا توجه ویژه به این ترکیبات در جهت درمان گروه‌های متفاوت سرطانی داشته باشند. طبق تحقیقاتی که Michael و همکاران در سال 2007 بر روی خواص آنتی‌اکسیدانی آناناس بر روی ملانوما انجام دادند مشخص شد که برومیلین جزئ اصلی فعال در میوه آناناس بوده و از دسته آنزیم های پروتئولیتیک محسوب می‌شود. پژوهش این محقق نشان‌دهنده باز داری واضح برومیلین از تکثیر سلولی. است (6). هم‌چنین قابل ذکر است طبق تحقیقاتی که توسط Bhui و همکاران در سال 2010 روی خاصیت سایتوتوکسیک آناناس در القای آپاپتوز در سلول‌های سرطان سینه انجام شد، مشخص شد که سلول‌های سرطانی MCF-7 که تحت تیمار با برومیلین به‌دست آمده از میوه آناناس بودند، پاسخ مهاری تاخیر رشد القای اتوفاژی را نشان دادند که این مساله به علت نقش برومیلین بر تنظیم فسفریلاسیون خارج سلولی است (20). در پژوهش حاضر بارگذاری عصاره آناناس به جهت افزایش شاخصه‌های سایتوتوکسیک آن در نانولیپوزوم‌های ساخته شده از فسفاتیدیل کولین سویا و در راستای عملکرد بهتر این عصاره صورت گرفت و با انجام تست DPPH نیز خاصیت آنتی‌اکسیدانی عصاره و از طریق تست‌های بیوشیمیایی وجود ترکیبات مختلف آنتی‌اکسیدانی در این عصاره تأیید شد. از آنجا که ترکیبات گیاهی در مقایسه با ترکیبات شیمیایی عوارض جانبی کمتری دارند لذا شناسایی استراتژی‌های نوین به‌منظور بهبود سیستم دارورسانی گیاهان دارویی که بتواند جایگزین مناسبی برای سیستم‌های دارورسانی شیمیایی باشد قادر است بسیاری از چالش‌های ایجاد شده در علم پزشکی را مرتفع سازد. پژوهش پیش رو نشان می‌دهد نانو سامانه‌های تهیه شده با درصد انکپسولاسیون40% برای آناناس‌، آهسته رهش هستند و حداکثر رهایش عصاره آناناس در شرایط دمایی و pH سلول‌های نرمالو سرطانی 70/96 است. بررسی آنالیز FTIR و مقایسه FTIR‌های حاصل از عصاره آناناس، لیپوزوم بلانک و لیپوزوم‌های حاوی عصاره نشان دهنده این امر است که عصاره موقعیت دارویی خود را به خوبی حفظ کرده و با نانو حامل لیپوزومی بر‌همکنش نداشته است. آنالیز نانوذرات با دستگاه DSL تایید کننده این امر است که نانولیپوزوم بلانک ضمن برخورداری از سایز 82/4 نانومتر، یکنواخت و از نظر بار، آنیونی بوده و از سمیت پایینی برای سلول برخوردار است. اندازه نانولیپوزوم بعد از لود عصاره آناناس به 9/89 نانومتر رسید که نشان دهنده سایز مناسب این نانولیپوزوم‌های حاوی دارو می‌باشند. پتانسیل زتای نانوذره بعد از لود عصاره آناناس از 35- به 8/8- رسید که این مسئله به‌خاطر حضور ترکیبات کاتیونی نظیر عناصری چون Mg، K، Ca و ZN در عصاره این میوه است. همین مسئله میزان لود عصاره آناناس را تحت تاثیر قرار داده است به‌طوری که میزان لود عصاره آناناس 40% می‌باشد. تصاویر حاصل از میکروسکوپ فلورسانس (AFM) نشان دهنده این مهم است که نانوذرات مربوط به عصاره ضمن برخورداری از اندازه و توزیع مناسب، دارای شکل کروی نیز می‌باشند. تست DPPH مربوط به عصاره و نانوحامل‌های حاوی آن نشان دهنده ظرفیت بالای آنتی‌اکسیدانی عصاره آناناس بوده و اینکه در ارتباط با عصاره در حالت کپسوله ظرفیت آنتی‌اکسیدانی بیشتر از حالت عصاره تنها می‌باشد. بررسی اثر سایتوتوکسیک عصاره آناناس و لیپوزوم‌های حاوی عصاره آناناس بر سلول‌های رده A375 ملانوما نشان می‌دهد که میزان سمیت سلولی در تمام غلظت‌ها و زمان‌ها برای عصاره و لیپوزوم مربوط به آن‌ها متناسب با دوز و زمان بوده است به طوری‌که عصاره و لیپوزوم حاوی عصاره آناناس با افزایش غلظت و زمان سبب کاهش بیشتر میزان بقا می‌شود. در سال 1397 عسکری و همکاران وزیکول‌های نیوزومی حاوی عصاره پوست انار با اندازه 143/6 نانومتر و شارژ سطحی 40/9- را به‌منظور اثر‌گذاری بر سلول‌های MCF7 تهیه نمودند (19). اندازه کمتر نانوذره ساخته شده در پژوهش اخیر به علت رسانش بهتر دارو به سلول و جنس لیپوزومه آن به علت مشابهت بیشتر با غشای سلولی از مزیت‌های این پژوهش است. رئیسی و همکاران در سال 1395 اثر ضد سرطانی عصاره آناناس (برومیلین) را بر روی رده سلولی سرطان پستان (4T1) بررسی کردند. آنها رده سلولی سرطان پستان (4T1) را تحت تاثیر غلظت‌های مختلف برومیلین و در زمان‌های متفاوت 2، 24، 48 و 72 ساعت در انکوباتور قرار داد و در نهایت رشد و تکثیر آن‌ها را به روش MTT مورد بررسی قرار داد. نتایج نشان داد که رشد و بقای سلول‌های4T1  وابسته به غلظت‌های مختلف برومیلین و در زمان‌های متفاوت به‌طور قابل توجهی کاهش یافت اما در زمان انکوباسیون کوتاه دو ساعته منجر به افزایش رشد و بقای سلول‌های سرطانی شد و این مسئله نشان می‌دهد برومیلین در زمآن‌های طولانی انکوباسیون دارای اثرات سمیت سلولی بر رشد و تکثیر سلول‌های4T1 می‌باشد (2). از مزیت پژوهش حاضر نسبت به پژوهش رئیسی استفاده از دامنه وسیع‌تری بازه های زمانی و نیز استفاده از تیمار عصاره و نانولیپوزوم حاوی عصاره است که بالطبع تاثیر بهتری دارد و نیز استفاده از 2 نوع تیمار (عصاره آناناس و نانولیپوزوم حاوی عصاره آناناس می‌باشد). نشاسته‌گیر و همکاران در سال 1395 از نانولیپوزوم‌های پوشش داده شده با کیتوزان برای ریزپوشانی اسانس روغنی پرتقال و گسترش دانش در زمینه نانوحامل ها به عنوان اجزا عملگرا در حوزه پیشگیری از بروز سرطان استفاده کردند. آن‌ها همچنین رفتار رهایش پایداری فیزیکی و حرارتی نانولیپوزوم‌ها را بررسی کردند. در تحقیق انجام شده قطر متوسط کلیه نانوحامل‌ها کمتر از ۲۵۰ نانومتر و شاخص پاشیدگی کمتر از 0/2 بود نانولیپوزوم‌های بدون پوشش دارای اندازه ذرات کمتر از ۱۰۰ نانومتر و پس از فرآیند پوشش‌دهی بین250-100 نانومتر بودند. پتانسیل زتا در لیپوزوم‌های بدون پوشش منفی و پس از فرآیند پوشش‌دهی مثبت بود. راندمان ریزپوشانی اسانس روغنی در نانولیپوزوم‌های بدون پوشش و پوشش داده شده به ترتیب بین 89-72 و ۶۲-۷۰ درصد بود. راندمان ریزپوشانی در نانوحامل‌های تولید شده با نسبت هسته پوسته 1:3و همچنین نسبت لستین به کیتوزان 20:1 بالاتر بود. تصاویر حاصل از میکروسکوپ الکترونی اتمی تشکیل نانولیپوزوم‌ها و صحت فرآیند پوشش‌دهی را تایید کرد. کینتیک رهایش اسانس روغنی پرتقال در شرایط مشخص بررسی شد اختلاف سرعت رهایش بین پوشش داده شده و پوشش داده نشده معنی‌دار بود. پایداری فیزیکی نانولیپوزوم‌های پوشش داده شده نسبت به بدون پوشش بسیار بالا بود (21). اندازه کوچکتر نانولیپوزوم ساخته شده درپژوهش اخیر و منفی بودن پتانسیل زتا قبل و بعد از لود عصاره در نانولیپوزوم و جنس ساختار نانوذره این پژوهش که لیپوزومه هست و استفاده از عصاره به جای اسانس از مزیت‌های این پژوهش است.
Lu و همکاران در سال ۲۰۱۱ نانولیپوزوم‌های حاوی پلی‌فنل‌های چای را تهیه کرده، خصوصیات فیزیکوشیمیایی آن‌ها را بررسی کردند. اندازه متوسط لیپوزوم‌های حاوی پلی‌فنل چای 160.4 نانومتر و مقدار پتانسیل زتا 67/2- بود. نتایج نشان داد که لیپوزوم‌های حاوی پلی‌فنل چای تهیه شده پایدار و مناسب برای کاربرد گسترده بود (22). اندازه کوچکتر لیپوزوم‌های ساخته شده در پژوهش حاضر و استفاده از دو نوع تیمار سلول‌ها هم با عصاره و هم با نانو‌لیپوزوم حاوی عصاره است که بالطبع تاثیر بهتری دارد.
نتیجه‌گیری
با استناد به نتایج به‌دست آمده ازاین پژوهش و نتایج مشابه آن در تحقیقات انجام شده می‌توان این گونه نتیجه گرفت که علت بالای خاصیت آنتی‌اکسیدانی عصاره به علت ترکیبات فلاونوئید و آنزیم برومیلین موجود در عصاره بوده که با آنتی‌اکسیدان‌ها واکنش داده و اثرات مخرب آن‌ها را کاهش می‌دهد و خاصیت سیتوتوکسیک آن به علت نقش برومیلین عصاره در کارکرد آنزیم‌های دخیل در سیکل سلولی سلول‌های سرطانی است، و لیپوزومه کردن عصاره به علت نفوذ بهتر به داخل سلول موجب اثر‌بخشی بهتر آن می‌شود. در این پژوهش با توجه به تایید خواص آنتی‌اکسیدانی عصاره و لیپوزوم حاوی عصاره و خواص ‌سامانه استفاده شده از لحاظ سایز و بار و خاصیت مورفولوژی و همچنین نتایج حاصل از بررسی بقای سلول‌ها در اثر تیمار با عصاره آناناس و نانوسامانه حاوی این عصاره و تایید خاصیت کشندگی این عصاره و نانو‌سامانه حاوی عصاره مذکور برای سلول‌های ملانوما رده  A375 و کاهش بیشتر بقای سلول‌های نامبرده در اثر تیمار با نانوسامانه حاوی عصاره نسبت به عصاره خالص و با توجه به آهسته رهش بودن سامانه استفاده شده، می‌توان پیشنهاد نمود که نانوسامانه ‌تهیه شده در این پژوهش با برخورداری از ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی مناسب می‌تواند جهت کاربردهای متعدد از جمله استفاده به‌عنوان ترکیبات آنتی‌اکسیدان و سایتوتوکسیک علیه سلول‌های سرطانی رده A375 مورد استفاده قرار گیرد.
سپاس‌گزاری
این مطالعه حاصل پایان‌نامه دانشجویی است. بدین‌وسیله نویسندگان مراتب تشکر و قدردانی خود را از حمایت‌های دانشگاه علم و هنر و شرکت دانش‌بنیان ریز زیست‌فناوران فردانگر در راستای انجام این مطالعه ابراز می‌دارند.
حامی مالی: ندارد.
تعارض درمنافع :وجود ندارد.

References:
1-Tomic T, Botton T, Cerezo M, Robert G, Luciano F, Puissant A, et al. Metformin Inhibits Melanoma Development through Autophagy and Apoptosis Mechanisms. Cell Death  Dis 2011; 2(9): e199.
2-Raeisi F, Raeisi E, Shahbazi-Gahrouei D, Heidarian  , Amiri M, Gholami M. Cytotoxicity Effect of Pineapple Extract on Breast Cancer Cells (4T1). J Isfahan Med Sch 2016; 34(394): 946-51. [Persian]
3- Bandarchi B, Ma L, Navab R, Seth A, Rasty G. From Melanocyte to Metastatic Malignant Melanoma. Dermatol Res Pract 2010; 2010: 1-8.
4-Giampieri F, Alvarez-Suarez JM, Mazzoni L, Forbes-Hernandez TY, Gasparrini M, Gonzàlez-Paramàs AM, et al. Polyphenol-Rich Strawberry Extract Protects Human Dermal Fibroblasts against Hydrogen Peroxide Oxidative Damage and Improves Mitochondrial Functionality. Molecules 2014; 19(6): 7798-816.
5-Nikkhah E, Khayami M, Heidari M. Evaluation of Nitric Oxide Scavenging Activity of Anthocyanins from Black Berry (Morus Nigra L.), Strawberry (Fragaria Vesca L.) and Berry)Morus Alba L. Var. Nigra) Extracts. Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants 2009; 25(1): 120-8. [Persian]
6-Michael A, Hedayati B, Dalgleish AG. Disease Regression in Malignant Melanoma: Spontaneous Resolution or a Result of Treatment with Antioxidants, Green Tea, and Pineapple Cores? A Case Report. Integr Cancer Ther 2007; 6(1): 77-9.
7-Roussis IG, Lambropoulos I, Soulti K. Scavenging Capacities of Some Wines and Wine Phenolic Extracts. Food Technology and Biotechnology 2005; 43(4): 351-8.
8-Zeng L-B, Zhang Z-R, Luo Z-H, Zhu J-X. Antioxidant Activity and Chemical Constituents of Essential Oil and Extracts of Rhizoma Homalomenae. Food chemistry 2011; 125(2): 456-63.
9- Afrin S, Giampieri F, Gasparrini M, Forbes-Hernandez TY, Varela-López A, Quiles JL, et al. Chemopreventive and Therapeutic Effects of Edible Berries: A Focus on Colon Cancer Prevention and Treatment. Molecules 2016; 21(2): 169-209.
10-Septembre-Malaterre A, Stanislas G, Douraguia E, Gonthier M-P. Evaluation of Nutritional and Antioxidant Properties of the Tropical Fruits Banana, Litchi, Mango, Papaya, Passion Fruit and Pineapple Cultivated in Ré:union: French Island. Food chem 2016; 212: 225-33.
11-Tysnes BB, Maurert HR, Porwol T, Probst B, Bjerkvig R, Hoover F. Bromelain Reversibly Inhibits Invasive Properties of Glioma Cells. Neoplasia 2001; 3(6): 469-79.
12-Sinha R, Kim GJ, Nie S, Shin DM. Nanotechnology in Cancer Therapeutics: Bioconjugated Nanoparticles for Drug Delivery. Mol Cancer Ther 2006; 5(8): 1909-17.
13-Castano AP, Mroz P, Hamblin MR. Photodynamic Therapy And Anti-Tumour Immunity. Nat Rev Cancer 2006; 6(7): 535-45.
14-Brannon-Peppas L, Blanchette JO. Nanoparticle and Targeted Systems for Cancer Therapy. Advanced drug delivery reviews 2012; 64(supplement): 206-212.
15-Nishiyama N, Kataoka K. Current State, Achievements, and Future Prospects of Polymeric Micelles as Nanocarriers for Drug and Gene Delivery. Pharmacol Ther 2006; 112(3): 630-48.
16-Bozzuto G, Molinari A. Liposomes as Nanomedical Devices. Int J Nanomedicin 2015; 10: 975-99.
17-Samad A, Sultana Y, Aqil M. Liposomal Drug Delivery Systems: An Update Review. Curr Drug Deliv 2007; 4(4): 297-305.
18-Deshpande PP, Biswas S, Torchilin VP. Current Trends in the Use of Liposomes for Tumor Targeting. Nanomedicine(Lond) 2013; 8(9): 1-32.
19-Askari M, Nikoonahad Lotfabadi N. Evaluation of Niosomal Nano-Carriers Capabilities on Toxicity Preservation and Delivery of Pomegranate Peel Extract in Cell Culture Conditions (MCF-7 Cell Line of Breast Cancer). DMed 2018; 26 (5): 9-20. [Persian]
20-Bhui K, Tyagi S, Prakash B, Shukla Y. Pineapple Bromelain Induces Autophagy, Facilitating Apoptotic Response in Mammary Carcinoma Cells. BioFactors 2010; 36(6): 474-82.
21-Mohebbi M,  Khodaparast MH,  Vendi M, Neshastehgir MH. Preparation of Nano-Liposomes Containing Orange Oily Essential Oil Using a Thermal Method. Journal of Innovation in Food Science and Technology 2018; 10(2): 115-22. [Persian]
22-Lu Q, Li D-C, Jiang J-G. Preparation of a Tea Polyphenol Nanoliposome System and its Physicochemical Properties. J Agric Food Chem 2011; 59(24): 13004-11.