ماهنامه علمی پ‍ژوهشی

مقدمه
با وجود پیشرفت‌های چشمگیر در روش‌های درمانی مبتنی بر خونرسانی مجدد نواحی ایسکمی میوکاردی، از دست رفتن کاردیومیوسیت‌ها به‌ویژه در زمان خونرسانی مجدد یکی از علل اصلی عوارض بعدی بیماری‌های قلبی عروقی است (1). از این‌رو استفاده از سلول درمانی به‌ویژه استفاده از سلول‌های بنیادی به عنوان یک استراتژی نویدبخش در جایگزینی سلول‌های از دست رفته و بهبود عملکرد سلول‌های باقی مانده مورد توجه خاصی قرار گرفته است (2،3). سلول‌های بنیادی گروهی از سلول‌ها با توانایی تمایز به سایر رده‌های سلولی و پتانسیل خودنوزایی مطرح هستند (4) که تقریباً در تمام بافت‌های بدن وجود دارند (5). سلول‌های بنیادی را به روش‌های متعددی تقسیم نموده¬اند (6). یکی از مهم‌ترین و کاربردی ترین دسته سلول‌های بنیادی، سلول‌های بنیادی مزانشیمی (MSC) هستند که تقریباً در تمام بافت‌های بدن مانند استخوان، پانکراس، طحال، روده، قلب و غیره وجود دارند (7). این سلول‌ها به دلیل خاصیت‌های ایمونومادولاتوری و آنتی‌تومری به عنوان یکی از سالم‌ترین سلول‌ها برای درمان بیماری‌های مختلف از جمله بیماری‌های ایسکمی قلبی در نظر گرفته شده‌اند (8). اگرچه بیشتر مطالعات بیان می‌دارند که سلول‌های بنیادی تزریق شده به روش‌های متعدد می‌توانند در ناحیه آسیب دیده میوکاردی قرار گیرند و به کاردیومیوسیت‌ها تبدیل شوند، اما تعداد این سلول‌ها بسیار کمتر از آن چیزی است که بتواند جوابگوی نیازهای فیزیولوژی میوکارد باشد (9). روش‌های متعددی برای تمایز MSCها به کاردیومیوسیت‌ها استفاده شده است شامل استفاده از مواد شیمیایی مانند 5- آزاسایتیدین (10)، استفاده از عصاره قلبی (11) و هم کشتی با کاردیومیوسیت‌ها (12). حداکثر تمایزی کاردیومیوسیتی که تا‌کنون با استفاده از روش‌های مذکور گزارش شده است در خصوص آزاسایتیدین بوده که حدود 30 درصد بوده است (13). آزاسایتیدین مهارکننده متیلاسیون DNA است که منجر به رونویسی، بیان ژن و تنظیم میوژنیک سلول‌ها می‌گردد. به همین دلیل از آن برای تمایزMSCها به سلول‌‌های شبه قلبی استفاده می‌شود. لذا به منظور افزایش میزان تفکیک MSCها به کاردیومیوسیت‌ها نیاز به تحقیقات بیشتری در آینده می‌باشد. همان‌طور که می‌دانید در زمان ایسکمی و خونرسانی مجدد بافتی یکسری مواد شیمیایی از سلول‌های آسیب دیده آزاد می‌شود که در غلظت‌های بسیار بالا موجب آسیب بافتی می¬شوند و در غلظت‌های کم باعث محافظت بافتی می‌شوند (14). در میان این مواد می¬توان به نیتریک اکساید، آدنوزین و رادیکال‌های آزاد اشاره کرد (1). در زمان پیش شرطی شدن ایسکمی غلظت‌های کمی از این مواد آزاد می‌شود و سلول‌های هدف را در برابر آسیب شدید بعدی محافظت می‌کنند (15). پیش شرطی شدن ایسکمی پدید‌های است که با دوره‌های کوتاه و مکرر ایسکمی و خونرسانی مجدد (1 تا 5 دقیقه) قبل از ایسکمی خونرسانی مجدد طولانی القاء می‌گردد (16). با توجه به توضیحات فوق در این مطالعه در نظر بوده است تا تاثیر پلاسمای تهیه شده از رت‌هایی که 1) قلبشان پیش شرطی ایسکمی شده، یا 2) ایسکمی طولانی شده و یا 3) بعد از ایسکمی طولانی به مدت 90 دقیقه خونرسانی مجدد شده است، بر تمایز MSC‌های استخراج شده از مغز استخوان رت‌های نوزاد به کاردیومیوسیت‌ها با آزاسایتیدین مورد ارزیابی قرار گیرد. علت استفاده از MSC‌های رت نوزاد این بوده است که تاثیر افزایش سن بر تفکیک و تمایز MSCها در مطالعه حذف گردد. امروز ثابت شده است که با افزایش سن تکثیر و تمایز سلول‌های بنیادی با افزایش سن به تدریج کاهش می¬یابد (17،18).
روش بررسی
این مطالعه تحقیقاتی یک کار تجربی – آزمایشگاهی است. به منظور تهیه پلاسما از 12 رت نر بالغ نژاد ویستار بخش حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد با محدوده وزنی 300–250 گرم و به منظور استخراج سلول‌های بینادی مغز استخوان از رت‌های نوزاد 7 روزه استفاده شد. رت‌ها در دمای 2±22 درجه سانتی‌گراد، رطوبت 55 درصد و سیکل تاریکی-روشنایی 12 ساعته نگهداری شدند. تمام حیوانات دسترسی آزاد به آب و غذا داشتند. تمام پروسیژر‌های جراحی طبق اصول بین المللی نگهداری و مراقبت از حیوانات آزمایشگاهی و تاییدیه کمیته اخلاق دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد انجام شد.
استخراج و کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان
در مطالعه حاضر از استخوان فمور و تیبیا رت نوزاد که با استفاده از CO2 بی‏هوش و یوتانازی شدند استفاده گردید. سوسپانسیون آماده شده از طریق فیلتر سل استرینر 4/0 میکرومتر فیلتر و سپس با دور 1200 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند. سوپرناتانت یا مایع رویی دور ریخته شد و پلت باقی مانده با 10 سی‌سی محیط کشت کامل پیپتاژ شد. محلول به‌دست آمده به پلیت 10 سی‌سی منتقل شد و در انکوباتور با رطوبت 95 درصد، دمای 37 درجه سانتی‌گراد، 5 درصد دی‌اکسید‌کربن قرار داده شد. سلول‌های استخراج شده بعد از 24 ساعت در زیر هود لامینار  با 5 سی‌سی P‏BS (هم دما با محیط) دو بار شستشو نموده و سپس محیط کشت کامل (‌هم دما با محیط‌) به آن اضافه شد. تعویض‌های بعدی محیط کشت هر 72-48 ساعت انجام شد تا زمانی که سلول‌ها به 80 درصد تراکم رسیدند. مایع رویی دور ریخته شد و با 5 سی‌سی P‏BS شستشو گردید. سلول‌های بنیادی مزانشیمی چسبیده شده به کف ظرف با تریپسین 0/25 درصد از کف ظرف جدا شدند. پس از غیر فعال‌سازی تریپسین با محیط کشت، محلول سلولی به مدت 10 دقیقه با دور 1200 سانتریفیوژ شد. مایع رویی دور ریخته شد و پلت با 2 سی‌سی محیط کشت کامل پیپتاژ شد. بعد از شمارش سلول ها، به ازای هر 1 سانتی متر مربع ظرف کشت 50 هزار سلول اضافه می‌شد و مانند کشت اولیه هر 48 تا 72 ساعت محیط را تعویض گردید تا سلول‌ها به Confluency 80 درصد برسند. این مرحله به عنوان اولین پاساژ سلولی در نظر گفته شد. برای ادامه مطالعه و تاثیر پلاسماها از سلول‌های پاساژ سوم استفاده شده تا یکنواختی بیشتری بین سلول‌ها وجود داشته باشد (19).
فلوسیتومتری سلول‌های جهت تایید نمودن سلول‌های MSC استخراج شده
برای شناسایی MSC‌ها از حضور مارکرهای CD44 و CD90 و عدم حضور CD45 و CD34 (مارکرهای سلول‌های بنیادی هماتوپویتیک) به روش فلوسیتومتری استفاده شد. زمانی که سلول‌های  MSCبه 80% شفافیت رسیدند سلول‌ها تریپسینه شده و در لوله ml15 جمع‌آوری شدند. سوسپانسیون به‌دست آمده درg  200 و دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ و سلول‌ها جمع‌آوری شدند. سلول‌های مربوطه با استفاده از PBS شست‌وشو شدند. سپس سلول‌ها در بافر رنگ‌آمیزی سلولی (حاوی PBS، سدیم آزید 5%‌، FBS 2%‌) با غلظت‌هایی 10-5 میلیون سلول در هر ml روی یخ معلق گردیدند. µl 100 از سوسپانسیون سلولی در لوله‌های مخصوص ریخته شده و آنتی بادی‌های C‏D44، CD90‌،CD45 ‌و CD34 به آن‏ها اضافه شد. حال لوله‌های مربوطه به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. سلول‌ها را 2 بار با PBS شستشو نموده و در  µl100 بافر رنگ آمیزی سلولی مجددا معلق شدند. به لوله‌ها‌stereptavidin-phycoerythin  (SA-PE) اضافه شد µg)15 به ازای هر میلیون سلول(. محلول در دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 دقیقه در تاریکی انکوبه شد. سلول‌ها در µl400 بافر رنگ‌آمیزی مجدداً معلق و برای فلوسیتومتری به تیوپ فالکون منتقل شدند (7). تبدیل MSC ها به رده استئوژنیک و آدیپوسیت جهت تایید نمودن قدرت تمایز سلول‌های MSC استخراج شده
برای تبدیل MSCها به استئوسیت، پس از اینکه سلول‌ها به Confluency 80 درصد رسیدند، به مدت 8 هفته در محیط کشت کامل حاوی دگزامتازون (^8-10 مول)، اسکوربیک اسید 2-فسفات (ml/ µg 5) و β-گلیسرول فسفات (mM10) انکوبه شدند. برای مشاهده رسوبات کلسیم، کشت‏ها با PBS شستشو شده و با استفاده از پارافرمالدئید 4 درصد در PBS به مدت 30-15 دقیقه در درجه حرارت اتاق فیکس و با محلول Alizarin Red (PH:‌4/2) رنگ‌آمیزی شدند. سپس کریستال‌های کلسیمی در زیر میکروسکوپ مشاهده شدند (10،19) برای تبدیل MSCها به آدیپوسیت‏ها، MSC به مدت 8 هفته در محیط کشت حاوی دگزامتازون (M ^8-10)، انسولین (µg/ml2/5)، ایندومتاسین (µM100) و رزیگلیتازون (µM‌3/5) انکوبه شدند. در این مرحله آدیپوسیت‏ها به آسانی با استفاده از میکروسکوپ فاز- کانترست از سلول‌های تفکیک نشده قابل شناسایی بودند. اما برای تاییدیه بیشتر ماهیت آن‏ها، سلول‌ها با استفاده از فرمالدهید 4 درصد در PBS  به مدت یک ساعت در درجه حرارت اتاق فیکس شدند. سپس با محلول Oil Red O به مدت 5 دقیقه رنگ آمیزی شدند. پس از یک دقیقه با Harrys hematoxiline رنگ آمیزی مخالف شدند. قطرات لیپیدی داخل سلولی به راحتی در زیر میکروسکوپ فاز‌– کنتراست قابل مشاهده بودند (10،19).
تمایزMSCها توسط 5-آزاسایتیدین
در این مرحله سلول‌ها از پاساژ سوم انتخاب و بعد از تریپسینه کردن و شمارش، تعداد 25000 به ازای هر سانتی‌متر مربع داخل پلیت  های 6 چاهکی کشت داده شدند. 24 ساعت بعد 5- آزاسایتیدین (µM 10، سیگما، آمریکا) طبق گروه¬بندی ذیل به آن‌ها اضافه شد. لازم به ذکر است که در مطالعات مختلف از دوزهای مختلف 5- آزاسایتیدین برای القا تمایز کاردیومیوژنیکی استفاده شد و از آنجایی‌که دوز 10میکرومولار بیشتر مورد استفاده قرار گرفته در این مطالعه از دوز 10میکرومولار استفاده شد (20). پس از 24 ساعت محیط کشت تعویض شد و دوزهای مد نظر از پلاسما طبق گروه‌بندی ذیل به سلول‌ها اضافه شد:
گروه‌بندی تجربی
برای انجام این مطالعه سلول‌های پاساژ سوم به شش گروه شش تایی ذیل تقسیم شدند:
1.    گروه کنترل: سلول‌های این گروه پس از این که 80 درصد ظرف کشت را پر نمودند، به مدت 28 روز فقط محیط کامل کشت دریافت نمودند (6=n).
2.    گروه آزاسایتیدین: سلول‌های این گروه پس از این که 80 درصد ظرف کشت را پر نمودند یک دوز آزاسایتیدین (10 میکرومول) دریافت نمودند، سپس به مدت 28 روز فقط محیط کامل کشت دریافت نمودند (6=n).
3.    گروه پلاسمای سالم. سلول  های این گروه پس از این که 80 درصد ظرف کشت را پر نمودند، یک دوز آزاسایتیدین (10 میکرومول) دریافت نمودند. سپس به مدت 28 روز محیط کامل به همراه پلاسمای تهیه شده از رت‌های سالم را دریافت نمودند (6=n).
4.     گروه پلاسمای ایسکمی. سلول‌های این گروه پس از این که 80 درصد ظرف کشت را پر نمودند، یک دوز آزاسایتیدین (10 میکرومول) دریافت نمودند. سپس به مدت 28 روز محیط کامل به همراه پلاسمای تهیه شده از رت‌های ایسکمی شده میوکاردی را دریافت نمودند (6=n).
5.    گروه پلاسمای ری پرفیوژن. سلول‌های این گروه پس از این که 80 درصد ظرف کشت را پر نمودند یک دوز آزاسایتیدین (10‌میکرومول) دریافت نمودند. سپس به مدت 28 روز محیط کامل به همراه پلاسمای تهیه شده از رت‌های ایسکمی- خونرسانی مجدد میوکاردی شده را دریافت نمودند (6=n).
6.    گروه پلاسمای پیش شرطی شده ایسکمی. سلول‌های این گروه پس از این که 80 درصد ظرف کشت را پر نمودند یک دوز آزاسایتیدین (10 میکرومول) دریافت نمودند. سپس به مدت 28 روز محیط کامل به همراه پلاسمای تهیه شده از رت‌های پیش شرطی شده ایسکمی میوکاردی شده را دریافت نمودند (6=n).
تهیه نمونه پلاسما
به منظور تهیه پلاسما حیوانات با کتامین - زایلازین (به ترتیب 100 و 10 میلی‌گرم به ازاء هر کیلو‌گرم وزن بدن) بی هوش شدند. لید دو الکتروکاردیوگرام با اتصال الکترودهایی به دست راست و پای چپ حیوان ثبت شد. فشار خون‌های شریانی با وارد نمودن کانولی به داخل شریان کاروتید به‌طور مداوم ثبت شد. سپس به منظور ایجاد ایسکمی و ری پرفیوژن نخ بخیه 0-5 پروپیلن از زیر شریان قدامی کرونر چپ عبور داده شد و طبق گروه‌های مورد نظر ایسکمی و ری پرفیوژن ایجاد شد. در گروه‌های سالم ایسکمی ایجاد نشد. در گروه پیش شرطی ایسکمی با 3 دوره 5 دقیقه‌ای ایسکمی-خونرسانی مجدد پیش شرطی شدن میوکاردی انجام شد. در گروه ایسکمی فقط 30 دقیقه ایسکمی اتفاق افتاد و در گروه خونرسانی مجدد 30 دقیقه ایسکمی و 90 دقیقه خونرسانی مجدد صورت گرفت. در پایان مراحل مذکور نمونه خون هپارینه از حیوانات جمع‌آوری و پس از سانتریفوژ کردن در دور 1200 به مدت 10 دقیقه پلاسما جمع‌آوری و تا زمان استفاده در یخچال 80- الیکوت و ذخیره شد. میزان پلاسمای استفاده شده بر اساس غلظت پروتئین پلاسما که با استفاده از روش برادفورد اندازه‌گیری شده بود (Catalog Number:‌DB0017-625a، شرکت کالازیست، ایران)، 25 میکروگرم در هر میلی‌لیتر محیط کشت انتخاب شد (21،22). در این مطالعه برای تهیه پلاسمای کافی برای هر گروه (گروه‌های 3 تا 6) از 3 سر رت استفاده شد. پس از اضافه نمودن پلاسما به محیط کشت سلول‌ها، محیط کشت ها را داخل انکوباتور قرار داده و‌ 3-2 روز یکبار با محیط کشت تازه و پلاسما طبق گروه‌بندی که در بالا ذکر شد تعویض شدند. گروه‌های سلولی 21 روز پس از کشت اولیه جمع‌آوری شدند. در طی این مدت سلول‌ها از لحاظ شکل، اندازه و حرکت پایش می¬شدند.
ﺑﺮرﺳﯽ ﺗﻐﯿﯿﺮات ﺳﻄﺢ mRNA ژن های هدف توسطPCR  - Real time RT
برای بررسی بیان ژن‌های دسمین، MHC-β و تروپونینI که نشانه‌هایی از سلول‌های کاردیومیوسیت می باشند، از روش Real-time PCR استفاده شد. بدین صورت که ابتدا با استفاده از محلول RNXplus (سیناژن- ایران) و مطابق دستورالعمل شرکت سازنده استخراج RNA صورت گرفت. کمیت و کیفیت RNA استخراج شده با قرائت جذب نوری نمونه در طول موج‌های 260 و 280 نانومتر و بررسی نسبت آن تعیین گردید. نمونه‌های RNA به فریزر 80- منتقل گردید و یا جهت سنتز cDNA مورد استفاده قرار گرفت. سنتز cDNA توسط کیت مخصوص (پارس طوس- ایران) حاوی پرایمر رندوم هگزامر، نوکلئوتیدهای لازم و آنزیم ترنس‌کریپتاز معکوس بر روی حجمی معادل 1000 نانوگرم RNA صورت گرفت. نمونه‌های cDNA به فریزر 20- منتقل شدند. نمونه‌ها در حضور پرایمرهای اختصاصی و مسترمیکس حاوی سایبرگرین (یکتا تجهیز - ایران) تحت واکنش Real time PCR قرار گرفتند. ژن بتا-اکتین به‌عنوان رفرنس در نظر گرفته شد. توالی پرایمرها در جدول 1 نشان داده شده است. بیان ژن های هدف به روش 2-ΔΔct تعیین گردید.
روش اندازه‌گیری میزان مهاجرت سلول‌ها
برای تعیین زمان مهاجرت سلول‌ها ابتدا تعداد 100هزار سلول به ازاء هر سانتی‌متر مربع در ظرف محیط کشت دانه‌گذاری شد. زمانی که سلول‌ها به تراکم 80 درصد رسیدند، با استفاده از تیغ بیستوری یک خراش در کف ظرف کشت ایجاد شد و نهایتاٌ پس از 24 ساعت درصد پر شدن ناحیه مذکور را تعیین اندازه‌گیری شد.
 

جدول1: توالی پرایمر‌های مورد استفاده جهت انجام واکنش  Real time RT-PCR




روش اندازه‌گیری دابلینگ تایم
برای تعیین دابلینگ تایم سلول‌ها ابتدا تعداد 100هزار سلول به ازاء هر سانتی‌متر مربع در ظرف محیط کشت دانه‌گذاری شد. بعد از گذشت حدوداٌ 24 ساعت تعداد سلول‌های دیش شمارش شدند و توسط فرمولی که در زیر آمده است (23) دابلینگ تایم محاسبه شد:
DT = t  log(2)/(log NH – log NI)
t = کل زمان از شروع کشت تا اندازه‌گیری نهایی
NH = تعداد سلول‌های نهایی
NI = تعداد سلول‌های کشت داده شده اولیه در ظرف کشت
تجزیه و تحلیل آماری
برای انجام این مطالعه از نرم‌افزار گراف پد پریزم 8 استفاده شد. داده‌ها به‌صورت انحراف‌معیار ± میانگین نشان داده شده است. با توجه به اینکه داده‌ها از توزیع نرمال برخوردار بودند از آنالیز واریانس یک طرفه با پس آزمون توکی برای آنالیز داده‌ها استفاده شد. در نهایت P<0.05 از لحاظ آماری معنادار در نظر گرفته شد.
ملاحظات اخلاقی
پروپوزال این تحقیق توسط دانشگاه دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد تایید شده است (کد اخلاق IR.SSU.MEDICINE.REC.1400.006).
نتایج
استخراج و تکثیر سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان
سلول‌های استخراج شده از مغز استخوان‌های فمور و تیبیا، پس از کشت در فلاسک مخصوص به دو گروه تقسیم شدند: 1) سلول‌های هماتوپویتیک یا خونساز که به شکل گرد و شناور دیده می‌شوند که به راحتی با تعویض محیط کشت و شستشوی سلول‌ها، از محیط خارج می‌شدند، 2) سلول‌های چسبان به کف فلاسک که سلول‌های مزانشیمی مغزاستخوان خوانده می¬شوند. این سلول ها در روز های اول کشت به تعداد اندک، کوچک و گرد هستند. (شکل A1) نمایی از سلول‌های هماتوپوتیک و سلول‌های چسبیده مزانشیمی (فلش) را 24 ساعت بعد از استخراج نشان می‌دهد. با تعویض محیط کشت هر 3-2روزیک بار، سلول‌های خون‌ساز پس از یک هفته به صورت کامل از محیط کشت خارج شدند (شکل B1). در این زمان تک لایه ای از سول‌های چسبیده به کف فلاسک دیده می¬شد که به تراکم80 -70 درصدی رسیده بودند (شکل C1). سلول ها عمدتاً دوکی شکل و شبه فیبروبلاستی بودند و تعدادی سلول گرد، پهن و ستاره‌ای در کف ظرف دیده می‌شد. با انجام اولین پاساژ‌، سلول‌ها در طی یک هفته به تراکم حداکثری رسیدند و تک لایه‌ای از سلول‌ها با مورفولوژی کشیده دیده شد. در طی پاساژ دوم سلول‌های کشیده شبه فیبروبلاستی افزایش یافتند. در این پاساژ هم سلول‌ها پس از 5-4 روز به تراکم حداکثری رسیدند. در پاساژ سوم سلول‌ها از نظر مورفولوژی تقریباً یکنواخت شده بودند و مورفولوژی دوکی شکل داشتند و برای ادامه کار از آن‌ها استفاده شد (شکل C1).
 



                                                               
شکل1: نمایی از ظاهر و تراکم سلول‌های استخراج شده.
 شکل A نمایی از سلول ها را بعد از اولین شستشو نشان می‌دهد. فلش ها سلول‌های بنیادی مزانشیمی چسبیده به کف ظرف را نشان می‌دهند. شکل B نمایی از ظاهر سلول‌ها را در روز هفتم نشان می‌دهد. شکل C نمایی از سلول‌ها را در پاساژ سوم با تراکم بالای 80 درصد نشان می‌دهد.
 
شناسایی MSCها با فلوسایتومتری
برای انجام فرآیند فلوسایتومتری، سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان پس از پاساژ سوم، به مرکز فلوسایتومتری رها واقع در تهران ارسال شد و نتایج حاصل از آن نشان داد که سلول‌ها نسبت به مارکر‌های مزانشیمی CD44 و CD90 مثبت و نسبت به مارکر‌های هماتوپویتیک CD34  و CD45 منفی هستند، نمودار های فلوسایتومتری هر آنتی‌بادی به صورت جداگانه در شکل‌ 2 نشان داده شده است.
بررسی اثر پلاسمای استخراج شده از رت‌ها بر تمایز MSCها به آدیپوسیت
شکل‌های 3 نشان می‌دهند که میزان تفکیک سلول‌های بنیادی مزانشیمی به آدیپوسیت‌ها هیچ تفاوت معناداری بین گروه‌‌های مختلف نسبت به گروه کنترل و حتی بین گروه‌های دیگر وجود نداشته است. نکته قابل‌تامل این است که در مطالعه کنونی این ارزیابی به صورت ظاهری انجام شده است.
بررسی اثر پلاسمای استخراج شده از رت‌ها بر تمایز MSCها به استئوسیت
شکل 4 نشان می‌دهد که میزان تفکیک سلول‌های بنیادی مزانشیمی به استئوسیت‌ها هیچ تفاوت معناداری بین گروه‌های مختلف نسبت به گروه کنترل و حتی بین گروه‌های دیگر وجود نداشته است. نکته قابل تامل این است که در مطالعه کنونی این ارزیابی به صورت ظاهری انجام شده است.
بررسی اثر پلاسمای استخراج شده از رت‌ها بر بیان ژن‌های MHC-β‌، Desmin و تروپونین I در MSCها در حضور 5-آزاسایتیدین
همانطور که در شکل 5 نشان داده شده است بر اساس نتایج به دست آمده مشخص شد که آزاسایتیدین بیان ژن‌های MHC-β‌، Desmin و تروپونین I را به‌طور معناداری در مقایسه با گروه کنترل افزایش داده است. اضافه نمودن پلاسمای استخراج شده از رت‌های نرمال یا بدون ایسکمی میوکاردی (Norm)، رت‌ های ایسکمی شده‌ میوکاردی (Isc)، رت‌های ایسکمی خونرسانی مجدد شده میوکاردی(Rep) و رت‌های پیش شرطی شده ایسکمی میوکاردی (Pre) در غلظت 25 میکروگرم در میلی‌لیتر تاثیری بر بیان این سه ژن در حضور آزاسایتیدین نداشته است. هیچ اختلاف معناداری در بیان ژن‌های MHC-β‌، Desmin و تروپونین I در گروه‌های دریافت‌کننده پلاسما‌های مختلف وجود نداشته است.
 



   
شکل 2: آنالیز فلوسایتومتری MSC ها.
 مارکر های CD90 و CD44 به عنوان مارکر‌های مزانشیمی و مارکر‌های CD45 و CD34 به عنوان مارکر‌های هماتوپوئتیک در نظر گرفته شده‌اند.




                                                               
شکل 3: تاثیر پلاسمای استخراج شده از رت بر تمایز MSC ها به آدیپوسیت.
A، گروه کنترل؛ B، گروه نرمال؛ C، گروه ایسکمی؛ D، گروه ری پرفیوژن؛ E، گروه پیش شرطی.



                    
شکل 4: تاثیر پلاسمای استخراج شده از رت بر تمایز MSC‌ها به آدیپوسیت.
A، گروه کنترل؛ B، گروه نرمال؛ C، گروه ایسکمی؛ D، گروه خونرسانی مجدد؛ E، گروه پیش شرطی.




                                              
شکل 5: تاثیر پلاسمای استخراج شده از رت بر تمایز MSC‌ها به کاردیومیوسیت‌ها در حضور 5-آزاسایتیدین. Ctrl، گروه کنترل؛ Aza، گروه آزاسایتیدین به تنهایی؛Norm، گروه دریافت‌کننده پلاسمای رت های بدون ایسکمی؛ Isc، گروه دریافت‌کننده پلاسمای رت‌های ایسکمی شده؛ Rep، گروه دریافت‌کننده پلاسمای رت‌های ایسکمی – ری پرفیوژن شده؛ Pre، گروه دریافت‌کننده پلاسمای رت‌های پیش شرطی شده. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار نشان داده شده است. *، ** و *** به معنای اختلاف معنادار نسبت به گروه کنترل است.
 
بررسی اثر پلاسمای استخراج شده از رت‌ها بر دابلینگ تایم و مهاجرت MSCها
همانطور که در شکل A6 نشان داده شده است، اضافه نمودن پلاسمای استخراج شده از رت‌های نرمال یا بدون ایسکمی میوکاردی (Norm)، رت‌های ایسکمی شده میوکاردی (Isc)، رت¬ های ایسکمی خونرسانی مجدد شده میوکاردی (Rep) و رت‌های پیش شرطی شده ایسکمی میوکاردی (Pre) در غلظت 25 میکروگرم در میلی‌لیتر به MSCها به مدت 28 روز تاثیر معناداری بر میزان دابلینگ تایم آن‌ها نداشته است. در مقایسه با گروه کنترل نداشته است. هم‌چنین شکل B5 نشان می‌دهد که اضافه نمودن پلاسمای استخراج شده از رت‌های نرمال یا بدون ایسکمی میوکاردی (Norm)، رت¬ های ایسکمی شده میوکاردی (Isc)، رت‌های ایسکمی خونرسانی مجدد شده میوکاردی (Rep) و رت‌های پیش شرطی شده ایسکمی میوکاردی (Pre) در غلظت 25 میکروگرم در میلی‌لیتر در حضور آزاسایتیدین به MSCها به مدت 28 روز تاثیر معناداری بر مهاجرت آن‌ها در مقایسه با گروه کنترل نداشته است.
 


شکل 6: تاثیر پلاسمای استخراج شده از رت بر دابلینگ تایم و مهاجرت MSCها. Ctrl، گروه کنترل؛Norm ، گروه دریافت‌کننده پلاسمای رت‌های بدون ایسکمی؛ Isc، گروه دریافت‌کننده پلاسمای رت‌های ایسکمی شده؛ Rep، گروه دریافت‌کننده پلاسمای رت های ایسکمی – ری پرفیوژن شده؛ Pre، گروه دریافت‌کننده پلاسمای رت‌های پیش شرطی شده. داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار نشان داده شده است.
 
بحث
نتایج مطالعه کنونی نشان داد که سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت هنگامی که در مواجهه با محیط حاوی 5- آزاسایتیدین قرار می¬گیرند به سلول‌های شبه کاردیومیوسیتی تبدیل شده و ژن‌های MHC-β، Desmin و تروپونینI را بیان می‌نمایند. اضافه نمودن پلاسمای استخراج شده از رت‌های نرمال یا بدون ایسکمی میوکاردی (Norm)، رت‌های ایسکمی شده میوکاردی (Isc)، رت‌های ایسکمی خونرسانی مجدد شده میوکاردی (Rep) و رت‌های پیش شرطی شده ایسکمی میوکاردی (Pre) هیچ تاثیری بر بیان این ژن¬ها در حضور 5- آزاسایتیدین نداشته است. پیشرفت‌های اخیر در زمینه سلول‌های بنیادی موجب درک بهتر از چگونگی تمایز این سلول‌ها و هم‌چنین گشودن افق‌های تاز‌ه‌ای در زمینه سلول درمانی گشته است (24). از شایع‌ترین بیماری‌های قلبی می‌توان به انفارکتوس میوکاردی اشاره کرد که منجر به مرگ سلولی غیرقابل برگشت در بخشی از عضله قلبی می¬شود و درصد بالایی از مرگ و میر را در سطح جهان به خود اختصاص داده است (25،26). مهندسی بافت با جایگزین کردن کاردیومیوسیت‌های متمایز شده از سلول‌های بنیادی در بافت آسیب دیده یا از بین رفته، امید تاز‌ه‌ای را در بیماران مبتلا یا مستعد به انفارکتوس میوکاردی زنده کرده است (2،3،7،27). از جمله سلول‌های بنیادی که کاربرد زیادی در تمایز به سلول‌های قلبی را دارند می‌توان به سلول بنیادی مزانشیمی مغز استخوان اشاره کرد. نتایج مطالعه حاضر نشان داد که سلول‌های بنیادی به‌دست آمده از مغزاستخوان با بیان مارکر‌های سطحی مزانشیمی  CD44و CD90 و عدم بیان مارکر‌های هماتوپویتیک CD34 وCD45  ویژگی بنیادی بودن را بروز می‌دهند. نتایج مربوط به بیان این مارکرها مطابق با مطالعات انجام شده توسط سایر محققان است (10،28). مطالعات نشان داده‌اند که سلول‌های بنیادی مزانشیمی تحت شرایط مناسب به انواع رده‌های سلولی مشتق از اکتودرم (سلول عصبی) و مزودرم (غضروف‌، استخوان‌، چربی و عضله) تمایز می‌یابند (3،29). در مطالعه کنونی نیز ظهور ندول‌های استخوانی (در سلول‌های القاشده توسط محیط تمایز به استئوسیت) و هم‌چنین آشکارشدن واکوئل‌های چربی (در سلول‌های تیمار شده در محیط تمایز به آدیپوسیت) به ترتیب با رنگ‌آمیزی آلیزارین رد و اویل رد او، گواه بر تمایز سلول‌های مزانشیمی به استئوسیت و آدیپوسیت است. بنابراین چندتوانی این سلول‌ها مورد تایید قرار گرفت. سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغزاستخوان در بیشتر زمان‌ها در حالت غیرفعال قرار دارند و هنگامی که در معرض یک محرک (ایسکمی‏ها، مواد شیمیایی، کم‏خونی) قرار بگیرند می‏توانند مهاجرت نموده و به سلول‌های بافت‏‌های هدف تمایز پیدا کنند (10،19،30). 5-آزاسایتیدین مهارکننده متیلاسیونِ DNA  است که منجر به رونویسی، بیان ژن و تنظیم میوژنیک سلول‌ها می‌گردد. به همین دلیل از آن¬ برای تمایزMSCها به سلول‌های شبه قلبی استفاده می¬شود (10،21). نتایج مطالعه کنونی نشان داد 5-آزاسایتیدین با دوز Mµ10 به طور معنی‌داری بیان مارکر‌های قلبی از جمله MHC-β، Desmin و تروپونین I را در سلول‌های بنیادی مزانشیمی رت افزایش می‌دهد. طبق آنالیز‌های آماری انجام شده بیان این ژن¬ها در گروه Aza افزایش معناداری داشته است. در همین راستا، اثرات کاردیومیوژنیکی 5- آزاسایتیدین در مطالعات دیگری نیز مورد بررسی قرار گرفته است. Makino و همکاران در سال 1999 برای اولین بار نشان دادند که سلول‌های بنیادی مزانشیمی موش ها هنگامی که به مدت 24 ساعت در مواجه با 5-آزاسایتیدین قرار داده می¬شوند ساختار شبه میوسیتی به خود می‏گیرند و بعد از دو هفته ضربان خود به خودی در آن‌ها مشاهده می‏‏گردد. تجزیه و تحلیل ایزوفرم ژن‏‌های پروتئین‌های انقباضی از جمله زنجیره سنگین میوزین، زنجیره سبک میوزین و α-اکتینین نشان داد که فنوتیپ کاردیومیوسیت‌ها مشابه با کاردیومیوسیت‏‌های بطنی جنینی می‏باشد. به علاوه، این سلول‌ها قبل از تیمار شدن با 5-آزاسایتیدین Nkx2.5/Csx، GTAT-4، TEF-1 وMEF-2C mRNA  و بعد از مواجه با 5-آزاسایتیدین MEF-2A و MEF-2D را بیان نمودند (31). Rangappa و همکاران در سال 2014 اثر دوز های مختلف 5-آزاسیتیدین (1، 3، 6، 9، 12 میکرومول در لیتر) را در مدت زمان‌های مختلف تیمار (24، 48، 72 ساعت) بر روی سلول‌های مزانشیمی مشتق از بافت چربی آزمایش کرده و گزارش کرده¬اند حدود 30 درصد از سلول‌ها فنوتیپ کاردیومیوسیتی به خود گرفته¬اند (20). Fukuda نیز در تحقیقات خود، پس از تیمار سلول‌های مغزاستخوان موش با Mµ3 آزاسایتیدین در بیش از 30درصد سلول‌ها بیان مارکر‌های قلبی را مشاهده کرد (13). در مقابل Yu liu در تحقیقات خود اثر دوز‌های مختلف آزاسایتیدین (5 و 10 میکرومول در لیتر) را روی سلول‌های مزانشیمی مغزاستخوان رت مورد مطالعه قرار داد. نتایج رنگ‌آمیزی آنتی‌بادی و تکنیک وسترن بلات حاکی از عدم بیان مارکر‌های ویژه قلبی مثل‌Connexin43  و MHC بود و در هیچ کدام از گروه‌ها مورفولوژی کاردیومیوسیتی مشاهده نشد (32). علاوه بر 5-آزاسایتیدین، افزودن فاکتور‌هایی مانند آنژیوتانسین II ،11-wnt و 2-BMP در محیط کشت منجر به تقویت اثر آزاسایتیدینمی¬گردد (10،12). استفاده از پلاسمای سلولی که در مقابل محرکی مثل ایسکمی قرار گرفته است منجر به اثرات محافظتی بر روی سلول‌های مختلف بافتی شده است )33.( فاکتورهای رشد مختلف از قبیل پروتیئن مورفوژنیک استخوانی (BMP-2)، فاکتور رشد تبدیل کننده  β(TGF-β)، اریتروپویتین (EPO) و فاکتور رشد فیبروبلاستی (FGF) تمایز کاردیومیوژنیکی سلول‌های بنیادی را در شرایط آزمایشگاه تسریع می‌بخشند و اثر پیش برنده بر بیان مارکرهای اختصاصی قلبی از قبیل troponin I، MESP 1‌، CAA‌، MEF2c دارند (34،35). Nilgün Gedik و همکاران اثر واسطه¬ های بالقوه هومورال آزاد شده در جریان پیش شرطی شدن ایسکمی در بیمارانی که تحت عمل جراحی بای پس قلبی قرار گرفته¬اند را مورد بررسی قرار دادند و غلظت فاکتور‌هایی از قبیل پرولاکتین،‌troponin I ، Interleukin-1α، GDF-11، Interleukin-8، pentraxin-3، surviving، Interleukin-17 و  GHرا قبل و بعد از پیش شرطی شدن ایسکمی مورد اندازه¬گیری قرار دادند، نتایج این مطالعه نشان داد که پلاسمای پیش شرطی شده‌ ایسکمی با فعال‌کردن مسیر‌های سیگنالینگ داخل سلولی و فعالیت فاکتور رونویسیSTAT  در بطن چپ از طریق interleukin-1α اثرات محافظتی خود را اعمال می کند (36). Koji Ueno و همکاران گزارش کردند که به‌دنبال جراحی قفسه سینه در موش¬ها و کاهش جریان خون نخاع، ایسکمی طناب نخاعی (SCI) اتفاق می‌افتد و باعث فلج اندام تحتانی موش می¬شود. اما بستن آئورت شکمی به منظور ایجاد پیش شرطی شدن ایسکمی از راه دور (RIPC) در آن‌ها قبل از جراحی، موجب کاهش شدت آسیب ناشی از ایسکمی می‌شود. هم‌چنین بررسی همزمان فاکتور رشد اندوتلیال عروقی پلاسما (VEGF) 24 ساعت پس از RIPC، افزایش معنی‌داری داری را در سطح  VEGFپلاسما ایجاد کرد که با بررسی‌های میکرو RNA مشخص شد که این اثر با کاهش تنظیم miRNA-762 و miR-3072-5p همراه است و در نتیجه با افزایش سطح VEGF پلاسما محافظت در برابر ایسکمی عضو حاصل می‌شود (37). در مطالعه‌ای گزارش شد که میزان بیان ژن miR-24 در اگزوزوم‌های حاصل از پلاسمای رت‌های تحت RIPC بسیار بیشتر از اگزوزوم‌های حاصل از پلاسمای رت‌های گروه کنترل است و این اثر با انتقال miR-24 به روش پاراکرین به سلول‌ها منتقل می¬شود و آپوپتوز را کاهش می-دهد. miR-24 در اگزوزوم¬ها، نقشی اساسی را در واسطه گری تأثیرات محافظتی RIPC ایفا می کند. این اثرات محافظتی به صورت کاهش آپوپتوز سلول‌های قلب، کاهش اندازه انفارکت و بهبود عملکرد قلب نشان داده شد (38). در مطالعات دیگر نیز مشخص شد RIPC یک روش عملی و غیر تهاجمی برای حفاظت از قلب است به طوری که پلاسمای گرفته شده در فاز آخر RIPC در موش¬ های صحرایی و تزریق 1 تا 24 ساعت قبل از ایسکمی-‌خونرسانی مجدد در گروه دیگر از طریق ورید دمی و سپس رنگ‌آمیزی منطقه ایسکمی توسط Evans blue و triphenyltetrazolium chloride به وضوح اثرات محافظتی قلبی را نشان داد که قابل انتقال از طریق پلاسما است (39). لذا با توجه به توضیحات بیان شده در این مطالعه در نظر بوده است تا بررسی شود آیا پلاسمای رت‌هایی که در معرض زمان‌های مختلف ایسکمی و ری پرفیوژن قرار گرفته است تاثیری بر تمایز سلول بنیادی مزانشیمی رت‌ها دارد یا خیر؟ با توجه به مطالعات قبلی در مطالعه کنونی میزان پلاسمای مورد نظر به نحوی انتخاب شد که غلظت پروتئین پلاسما در محیط کشت 25 میکروگرم در میلی‌لیتر باشد (40). یافته‌های مطالعه جاری نشان می‌دهد که آزاسایتیدین با دوز 10 میکروگرم توانسته است MSCها را به کاردیومیوسیت تبدیل نماید که با اکثر یافته‌های قبلی هم‌خوانی دارد (10،41). اما اضافه نمودن پلاسمای زمان‌های مختلف ایسکمی و ری پرفیوژن نتوانسته‌اند اثری بر تبدیل MSCها به کاردیومیوسیت‌ها و حتی به اسئتوسیت‌ها و ادیپوسیت‌ها در شرایط آزمایشگاه اعمال نمایند. از اینرو پیشنهاد می‌گردد که مطالعات بیشتری در خصوص ترکیبات موجود در پلاسماها و میزان ترکیبات و نهایت غلظت آن‌ها در محیط کشت‌ها مورد ارزیابی بیشتر قرار گیرد. هم‌چنین پیشنهاد می‌گردد که غلظت‌های بیشتری از پلاسماها نیز در مطالعات بعدی استفاده گردد. هم‌چنین توصیه می‌شود که اثرات پلاسما‌های مورد نظر با سایر عوامل تبدیل کننده سلول‌های بینادی به کاردیومیوسیت‌ها از جمله هم کشتی با سلول‌های قلبی و استفاده از عصاره‌های بافت قلبی نیز مورد ارزیابی قرار گیرد. در نهایت در این مطالعه پلاسما‌های استفاده شده تاثیری بر میزان دابلینگ تایم و مهاجرت MSCها در شرایط آزمایشگاه نداشته است. امروزه ثابت شده است که با افزایش سن در بدن موجودات (17،18) و با افزایش تعداد پاساژها در محیط آزمایشگاه (42) قدرت تکثیر و تمایز سلول‌های بنیادی کاهش می‌یابد. از این‌رو در این مطالعه این متغیرها نیز بررسی شدند که در شرایط مطالعه کنونی تاثیری مشاهده نشد و نیاز است که طبق توضیحات قبلی در تحقیقات آینده مورد توجه بیشتری قرار گیرد.
نتیجه گیری
بر اساس یافته‌های این مطالعه می¬توان نتیجه کرد که مواجه نمودن MSCهای مغز استخوان رت نوزاد به مدت 28 روز به پلاسمای رت‌های بالغی که دچار ایسکمی میوکاردی به تنهای، یا ایسکمی – خونرسانی مجدد میوکاردی و یا پیش شرطی شدن ایسکمی میوکاردی شده‌اند، تاثیر معناداری بر تمایز آن‌ها به کاردیومیوسیت‌ها در حضور آزاسایتیدین ندارد. هم‌چنین تاثیر معناداری بر رشد و تکثیر آن‌ها نیز نداشته ندارد.
سپاس‌گزاری
این مقاله حاصل پایان‌نامه کارشناسی ارشد رشته فیزیولوژی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی و خدمات درمانی شهید صدوقی یزد به شماره 10370 می‌باشد. بدین‌وسیله از کلیه همکاران گروه فیزیولوژی این دانشکده که در انجام این پایان‌نامه ما را یاری نمودند تشکر و قدردانی می‌نماییم.
حامی مالی: دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد
تعارض در منافع: وجود ندارد.
 

References:
 
1-    Cheng B, Zhong JP, Wu FX, Li GL, Ruan QX, Luo G, et al. Ebselen Protects Rat Hearts Against Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury. Exp Ther Med 2019; 17(2): 1412-9.
2-    Barile L, Lionetti V, Cervio E, Matteucci M, Gherghiceanu M, Popescu LM, et al. Extracellular Vesicles from human Cardiac Progenitor Cells Inhibit Cardiomyocyte Apoptosis a/nd Improve Cardiac Function Aftermyocardial Infarction. Cardiovasc Res 2014; 103(4): 530-41.
3-    Labovsky V, Hofer EL, Feldman L, Vallone VF, Rivello HG, Bayes-Genis A, et al. Cardiomyogenic Differentiation of Human Bone Marrow Mesenchymal Cells: Role of Cardiac Extract from Neonatal Rat Cardiomyocytes. Differentiation 2010; 79(2): 93-101.
4-    Madonna R, Van Laake LW, Davidson SM, Engel FB, Hausenloy DJ, Lecour S, et al. Position Paper of the European Society of Cardiology Working Group Cellular Biology of the Heart: Cell-Based Therapies for Myocardial Repair and Regeneration in Ischemic Heart Disease and Heart Failure. Eur Heart J 2016; 37(23): 1789-98.
5-    Kobolak J, Dinnyes A, Memic A, Khademhosseini A, Mobasheri A. Mesenchymal Stem Cells: Identification, Phenotypic Characterization, Biological Properties and Potential for Regenerative Medicine through Biomaterial Micro-Engineering of their Niche. Methods 2016; 99: 62-8.
6-    Porrello ER, Mahmoud AI, Simpson E, Johnson BA, Grinsfelder D, Canseco D, et al. Regulation of Neonatal and Adult Mammalian Heart Regeneration by the Mir-15 Family. Proc Natl Acad Sci U S A 2013; 110(1): 187-92.
7-    Da Silva Meirelles L, Chagastelles PC, Nardi NB. Mesenchymal Stem Cells Reside in Virtually All Post-Natal Organs and Tissues. J Cell Sci 2006; 119(11): 2204-13.
8-    Liras A. Future Research and Therapeutic Applications of Human Stem Cells: General, Regulatory, and Bioethical Aspects. J Transl Med 2010; 8: 1-15.
9-    Karantalis V, Suncion-Loescher VY, Bagno L, Golpanian S, Wolf A, Sanina C, et al. Synergistic Effects of Combined Cell Therapy for Chronic Ischemic Cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol 2015; 66(18): 1990-9.
10-    Hou J, Lü AL, Liu BW, Xing YJ, Da J, Hou ZL, et al. Combination of BMP-2 and 5-AZA is Advantageous in Rat Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Differentiation Into Cardiomyocytes. Cell Biol Int 2013; 37(12): 1291-9.
11-    Massion PB, Dessy C, Desjardins F, Pelat M, Havaux X, Belge C, et al. Cardiomyocyte-Restricted Overexpression of Endothelial Nitric Oxide Synthase (NOS3) Attenuates Β-Adrenergic Stimulation and Reinforces Vagal Inhibition of Cardiac Contraction. Circulation 2004; 110(17): 2666-72.
12-    Zhang Z, Li H, Ma Z, Feng J, Gao P, Dong H, et al. Efficient Cardiomyogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells by Combination of Wnt11 and Bone Morphogenetic Protein 2. Exp Biol Med 2012; 237(7): 768-76.
13-    Fukuda K. Development of Regenerative Cardiomyocytes from Mesenchymal Stem Cells for Cardiovascular Tissue Engineering. Artif Organs 2001; 25(3): 187-93.
14-    Barzegar M, Kaur G, Gavins FNE, Wang Y, Boyer CJ, Alexander JS. Potential Therapeutic Roles of Stem Cells in Ischemia-Reperfusion Injury. Stem Cell Res 2019; 37: 101421.
15-    Goyal A, Agrawal N. Ischemic Preconditioning: Interruption of Various Disorders. J Saudi Hear Assoc 2017; 29(2): 116-27.
16-    Ayodele M, Koch S. Ischemic Preconditioning in the Intensive Care Unit. Curr Treat Options Neurol 2017; 19(6): 24.
17-    Asumda FZ, Chase PB. Age-Related Changes in Rat Bone-Marrow Mesenchymal Stem Cell Plasticity. BMC Cell Biol 2011; 12: 44.
18-    Beane OS, Fonseca VC, Cooper LL, Koren G, Darling EM. Impact of Aging on the Regenerative Properties of Bone Marrow-, Muscle-, and Adipose-Derived Mesenchymal Stem/Stromal Cells. Plos One 2014; 9(12): e115963.
19-    Xing Y, Lv A, Wang L, Yan X. The Combination of Angiotensin II and 5-Azacytidine Promotes Cardiomyocyte Differentiation of Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells. Mol Cell Biochem 2012; 360(1-2): 279-87.
20-    Rangappa S, Fen C, Lee EH, Bongso A, Wei ES. Transformation of Adult Mesenchymal Stem Cells Isolated from the Fatty Tissue Into Cardiomyocytes. Ann Thorac Surg 2003; 75(3): 775-9.
21-    Pham TLB, Nguyen TT, Van Bui A, Nguyen MT, Van Pham P. Fetal Heart Extract Facilitates the Differentiation of Human Umbilical Cord Blood-Derived Mesenchymal Stem Cells into Heart Muscle Precursor Cells. Cytotechnology 2016; 68(4): 645-58.
22-    Gaustad KG, Boquest AC, Anderson BE, Gerdes AM, Collas P. Differentiation of Human Adipose Tissue Stem Cells Using Extracts of Rat Cardiomyocytes. Biochem Biophys Res Commun 2004; 314(2): 420-7.
23-    Horwitz EM, Dominici M. How Do Mesenchymal Stromal Cells Exert their Therapeutic Benefit? Cytotherapy 2008; 10(8): 771-4.
24-    Keller G. Embryonic Stem Cell Differentiation: Emergence of a New Era in Biology and Medicine. Genes Dev 2005; 19(10): 1129-55.
25-    White IA, Sanina C, Balkan W, Hare JM. Mesenchymal Stem Cells in Cardiology. Inmesenchymal Stem Cells 2016 ; 1416:  55-87.
26-    Shim WSN, Jiang S, Wong P, Tan J, Chua YL, Seng Tan Y, et al. Ex Vivo Differentiation of Human Adult Bone Marrow Stem Cells into Cardiomyocyte-Like Cells. Biochem Biophys Res Commun 2004; 324(2): 481-8.
27-    Lye KL, Nordin N, Vidyadaran S, Thilakavathy K. Mesenchymal Stem Cells: from Stem Cells to Sarcomas. Cell Biol Int 2016; 40(6): 610-8.
28-    Zhang L, Chan C. Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCS) and Separation of Single-Colony Derived Mscs. J Vis Exp 2010; 37: 2-5.
29-    Connell JP, Augustini E, Moise KJ, Johnson A, Jacot JG. Formation of Functional Gap Junctions in Amniotic Fluid-Derived Stem Cells Induced by Transmembrane Co-Culture with Neonatal Rat Cardiomyocytes. J Cell Mol Med 2013; 17(6): 774-81.
30-    Martin-Rendon E, Sweeney D, Lu F, Girdlestone J, Navarrete C, Watt SM. 5-Azacytidine-Treated Human Mesenchymal Stem/Progenitor Cells Derived from Umbilical Cord, Cord Blood and Bone Marrow Do Not Generate Cardiomyocytes in Vitro at High Frequencies. Vox Sang 2008; 95(2): 137-48.
31-    Makino S, Fukuda K, Miyoshi S, Konishi F, Kodama H, Pan J, et al. Cardiomyocytes Can Be Generated from Marrow Stromal Cells in Vitro. J Clin Invest 1999; 103(5): 697-705.
32-    Liu Y, Song J, Liu W, Wan Y, Chen X, Hu C. Growth and Differentiation of Rat Bone Marrow Stromal Cells: Does 5-Azacytidine Trigger their Cardiomyogenic Differentiation? Cardiovasc Res 2003; 58(2): 460-8.
33-    Weber NC, Riedemann I, Smit KF, Zitta K, Van De Vondervoort D, Zuurbier CJ, et al. Plasma From Human Volunteers Subjected to Remote Ischemic Preconditioning Protects Human Endothelial Cells from Hypoxia–Induced Cell Damage. Basic Res Cardiol 2015; 110(2): 17.
34-    Bartunek J, Croissant JD, Wijns W, Gofflot S, De Lavareille A, Vanderheyden M, et al. Pretreatment of Adult Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells with Cardiomyogenic Growth Factors and Repair of the Chronically Infarcted Myocardium. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2007; 292(2): 1095-104.
35-    Selvaggi TA, Walker RE, Fleisher TA. Development of Antibodies to Fetal Calf Serum with Arthus-Like Reactions in Human Immunodeficiency Virus-Infected Patients Given Syngeneic Lymphocyte Infusions. Blood 1997; 89(3): 776-9.
36-    Gedik N, Kottenberg E, Thielmann M, Frey UH, Jakob H, Peters J, et al. Potential Humoral Mediators of Remote Ischemic Preconditioning in Patients Undergoing Surgical Coronary Revascularization. Sci Rep 2017; 7(1): 12660.
37-    Ueno K, Samura M, Nakamura T, Tanaka Y, Takeuchi Y, Kawamura D, et al. Increased Plasma VEGF Levels Following Ischemic Preconditioning are Associated with Downregulation of Mirna-762 and Mir-3072-5p. Sci Rep 2016; 6(1): 36758.
38-    Minghua W, Zhijian G, Chahua H, Qiang L, Minxuan X, Weifang Z, et al. Plasma Exosomes Induced by Remote Ischaemic Preconditioning Attenuate Myocardial Ischaemia/Reperfusion Injury by Transferring Mir-24. Cell Death & Disease 2018: 9; 1-14.
39-    Zhao Y, Zheng ZN, Cheung CW, Zuo ZY, Jin SQ. Transfusion of Plasma Collected at Late Phase after Preconditioning Reduces Myocardial Infarct Size Induced by Ischemia-Reperfusion in Rats in Vivo. Chin Med J (Engl) 2017; 130(3): 303-8.
40-    Sarmento B, Andrade F, Da Silva SB, Rodrigues F, Das Neves J, Ferreira D. Cell-Based in Vitro Models for Predicting Drug Permeability. Expert Opin Drug Metab Toxicol 2012; 8(5): 607-21.
41-    Shi S, Wu X, Wang X, Hao W, Miao H, Zhen L, et al. Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells to Cardiomyocyte-Like Cells is Regulated by the Combined Low Dose Treatment of Transforming Growth Factor- Β 1 and 5-Azacytidine. Stem Cells Int 2016: 2016; 3816256.
42-    Schultz MB, Sinclair DA. When Stem Cells Grow Old: Phenotypes and Mechanisms of Stem Cell Aging. Development 2016; 143(1): 3-14.